Summary
SC1 Funktionen durch duale Hemmung des Ras-GAP und ERK1. Wir testeten die Funktion von SC1 in Unterstützung von Maus ES-Zell-Selbst-Erneuerung in der Abwesenheit von LIF und zeigte, dass SC1 in der Lage, sich selbst zu erneuern von Maus-ES-Zellkulturen zu halten ist.
Abstract
Maus embryonale Stammzellen (ES-Zellen) sind konventionell mit Leukämie Inhibitory Factor (LIF), um sich selbst zu erneuern pflegen kultiviert.
Protocol
1. Vorbereitung der MEF Feeder-Platten
- Einen Tag vor Kultivierung ES-Zellen, Tauwetter ein Fläschchen von bestrahlten E14.5 CF-1 MEF Feeder-Zellen (siehe unsere Vorgehensweise zum ES-Zellen auftauen).
- Platte der MEF Feeder-Zellen bei einer Dichte von 10.000 Zellen / Well in einer 12-Well-Platte. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 37 ° C und 5% CO 2. MEF Zellen Medien: DMEM mit 10% ES-PBS, 1X Glutamin und 1X nicht-essentiellen Aminosäuren ergänzt.
2. Wartung von Self-Erneuerung der Maus ES-Zellen
- Lösen Sie die ES-Zellen unter Verwendung von Trypsin. Seed die Zellen bei einer Dichte von 50.000 Zellen / well auf die zuvor vorbereiteten MEF Feeder-Platten in Nährmedien (Knockout MEM mit 15% KSR, 4 mM L-Glutamin, 0,1 mM nicht-essentiellen Aminosäuren und 1X BME ergänzt) mit SC1 ergänzt in der gewünschten Konzentration (wir haben 100 nM, 300 nM und 1 pM). Außerdem haben wir eine positive Kontrolle gut, dass mit 1000 μ / ml LIF ergänzt wurde. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 37 ° C und 5% CO 2.
- Kultur der Zellen bei 37 ° C und 5% CO 2 für 3-4 Tage in jedem Durchgang. Refresh Medien alle 48 Stunden.
- Passage-Zellen von 1.10 bis 01.15 Uhr mit Trypsin ein ähnlicher Dichte wie die erste Aussaatdichte aufrecht zu erhalten. Nach 5 Passagen, können die Zellen auf die Expression von typischen Pluripotenz Marker mit Immunzytochemie untersucht werden.
3. Immunzytochemische Untersuchung der Pluripotenz Markers
- Waschen Sie die Zellen vorsichtig dreimal mit PBS.
- Fix die Zellen mit 500 ul Fixativ für 20 Minuten bei Raumtemperatur.
- Waschen Sie die Zellen vorsichtig dreimal mit PBS.
- Block unspezifische Bindung mit 500 ul Blockierungspuffer für eine Stunde bei Raumtemperatur.
- Inkubieren Sie die Zellen mit 250 ul des spezifischen primären Antikörper (wir Nanog, Sox2, SSEA1 und Oct4 bei den folgenden Verdünnungen: 1:500, 1:2000, 1:500 und 1:500)
- Waschen Sie die Zellen vorsichtig dreimal mit PBS.
- Inkubieren Sie die Zellen mit 250 ul des sekundären Antikörper für 2 Stunden bei Raumtemperatur, hielten sich fern von Licht (wir haben Esel anti-Maus konjugiert mit Alexa Fluor ® 555 bei 1:2000 und Esel-anti-Kaninchen konjugiert mit Alexa Fluor ® 488 bei 1 : 2000).
- Waschen Sie die Zellen vorsichtig dreimal mit PBS.
- Add DAPI (Endkonzentration 1 pg / ml) auf dem letzten Waschen und Inkubation 5 Minuten, um Kerne zu visualisieren.
- Analysieren Sie die Zellen unter einem Fluoreszenzmikroskop.
4. Repräsentative Ergebnisse:
1. Morphologie Ergebnisse:
Maus ES-Zellen (ESC R1) wurden am MEF Feeder-Zellen in Anwesenheit von entweder LIF oder SC1 gewachsen zu Selbst-Erneuerung in einem undifferenzierten Zustand halten. Nach dem zweiten Durchgang konnte die Differenzierung in Zellen ohne LIF oder SC1 (negative Kontrolle) beobachtet werden und nach 5 Passagen im Wesentlichen keine undifferenzierte Kolonien beobachtet wurden. LIF (positive Kontrolle) behandelt Kolonien blieb in einem undifferenzierten Zustand in den 5 Zellpassagen. Zellen, die mit SC1 in Konzentrationen von 300 nM oder 100 nM behandelt blieb auch nach 5 Passagen undifferenziert, aber die Zellen mit 1 uM SC1 erfahrenen Zelltod nach dem vierten Durchgang behandelt. (Bild 2 von app beachten) Tabelle 1 fasst die morphologische Beobachtungen.
2. Expression der Pluripotenz Markers
Maus ES-Zellen für 5 Passagen beibehalten wurden fixiert und untersucht durch Immunzytochemie für SSEA1, Oct4, Nanog und Sox2. Marker-Expression wurde ähnlich wie Zellen in LIF erhalten. (Abb. 3 und 4 des app beachten)
Abbildung 1: Morphologie Vergleich von Zellen in LIF oder SC1 gepflegt. Kein Unterschied in der Morphologie beobachtet.
Abbildung 2 und Abbildung 3: Nanog, SSEA1, Sox2 und Oct4 Färbung von ES-Zellen mit SC1 oder LIF (Abb. 4 von ca. beachten) gepflegt. Cells in SC1 gepflegt zeigen ähnliche Pluripotenz-Marker zum Ausdruck Zellen in LIF erhalten.
Tabelle 1
| Negative Control | LIF Positive Control | SC1 1um | SC1 300 nM | SC1 100 nM | |
| 1. Besuch | Normale ES Zellmorphologie | Normale ES Zellmorphologie | Normale ES Zellmorphologie | Normale ES Zellmorphologie | Normale ES Zellmorphologie |
| 2. Passage | Einige differenzierte Morphologie | Normale ES Zellmorphologie | Normale ES Zellmorphologie | Normale ES Zellmorphologie | Normale ES Zellmorphologie |
| 3. Passage | Mehrzahl der Zellen differenziert | Normale ES Zellmorphologie | Normale ES Zellmorphologie | Normale ES Zellmorphologie | Normale ES Zellmorphologie |
| 4. Passage | Kein ESC Kolonien | Normale ES Zellmorphologie | Der Zelltod beobachtet | Normale ES Zellmorphologie | Normale ES Zellmorphologie |
| 5th Passage | differenziert | Normale ES Zellmorphologie | Der Zelltod beobachtet | Normale ES Zellmorphologie | Normale ES Zellmorphologie |
Discussion
Das kleine Molekül SC1 kann zur Selbst-Erneuerung mit einem undifferenzierten Zustand in Maus-ES-Zellen zu erhalten. Vor dem Einsatz auf einer ungeprüften Zelllinie, jedoch sollte es titriert auf die optimale Konzentration zu bestimmen. Zum Beispiel, testeten wir drei Konzentrationen auf der Maus-ES-Zelllinie ESC R1. 100 nM und 300 nM Konzentrationen konnten Maus-ES-Zellen zu erhalten, war jedoch ein 1 pM Konzentration giftig.
SC1 kann auch unter Feeder-freien Bedingungen verwendet werden.
Acknowledgments
Die Autoren möchten Dr. Sheng Ding vom Scripps Research Institute und Dr. Hongkui Deng von der Peking-Universität für ihre Unterstützung und die Richtung zu danken.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SC1 | Stemgent | 04-0011 | |
| LIF | EMD Millipore | ESG1107 | |
| SSEA-1 antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | 21702 | |
| Nanog antibody | Abcam | ab21603 | |
| Sox2 antibody | Chemicon International | Ab5603 | |
| Oct4 antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-5279 |
References
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- Chen, S., Do, J. T., Zhang, Q., Yao, S., Yan, F., Peters, E. C., Scholer, H. R., Schultz, P. G., Ding, S. Self-renewal of embryonic stem cells by a small molecule. Proc. Natl. Acat. Sci. USA. 103, 17266-17271 (2006).
