Summary
SC1のRas - GAPとERK1のデュアル阻害による機能。我々は、LIFの不在下でマウスES細胞の自己複製をサポートするにSC1の機能をテストし、SC1は、マウスES細胞培養の自己複製を維持することができることを示した。
Abstract
マウス胚性幹（ES）細胞は、従来、自己複製を維持するために、白血病阻害因子（LIF）で培養する。
Protocol
1。 MEFフィーダープレートの準備
- 培養ES細胞前日、照射E14.5の雪解け1バイアルCF - 1 MEFフィーダー細胞（ES細胞を解凍する方法で私たちの手順を参照）。
- プレート12ウェルプレートに10,000細胞/ウェルの密度でMEFフィーダー細胞。 37℃、5％CO 2で一晩細胞をインキュベートする。 MEF細胞メディア：DMEM、10％ES - PBS、1Xグルタミンおよび1X非必須アミノ酸を添加した。
2。マウスES細胞の自己複製の保守
- トリプシンを用いてES細胞を切り離します。シードSC1を補充/よく増殖培地に予め用意されたMEFフィーダープレート上に50,000個の細胞（15％KSRを添加したノックアウトMEM、4mMのL -グルタミン、0.1mM非必須アミノ酸と1X BME）の密度で細胞所望の濃度での（我々は100nm、300 nm、および1μMを使用）。我々はまた、LIF 1000μ/ mlのを添加した陽性コントロールウェルを追加しました。 37℃、5％CO 2で一晩細胞をインキュベートする。
- 文化37細胞℃、5％、各継代で3〜4日間CO 2。リフレッシュメディア毎に48時間。
- 継代細胞の初期播種密度と同様の密度を維持するためにトリプシンで1:10に1：15。 5継代後、細胞は、免疫細胞化学を用いて典型的な多能性マーカーの発現を調べることができます。
3。多能性マーカーの免疫細胞化学的検討
- 細胞をPBSで穏やかに3回洗浄する。
- 室温で20分間、固定液500μlで細胞を固定する。
- 細胞をPBSで穏やかに3回洗浄する。
- 室温で1時間500μlのブロッキングバッファーで非特異的結合をブロックする。
- 特定の一次抗体を250μl（：1:500、1:2000、1:500、1:500と我々は以下の希釈でNanogの、レトロウイルスベクター、SSEA1、およびOct4のを使用）で細胞をインキュベート
- 細胞をPBSで穏やかに3回洗浄する。
- 室温で2時間二次抗体を250μlで細胞をインキュベートし、光から遠ざけること（我々は、1からのAlexa Fluor ® 488で1:2000とロバ抗ウサギ共役でのAlexa Fluor ® 555と結合ロバ抗マウスを使用：2000）。
- 細胞をPBSで穏やかに3回洗浄する。
- 最後の洗浄のためにDAPIを（最終濃度1μg/ ml）を追加し、核を可視化するために5分間インキュベートする。
- 蛍光顕微鏡下で細胞を分析する。
4。代表的な結果：
1。形態の結果：
マウスES細胞（ESC R1）は未分化状態で自己複製を維持するためにLIFまたはSC1のどちらかの存在下でMEFフィーダー細胞上で増殖させた。第2通路の後、分化がLIFまたはSC1（ネガティブコントロール）することなく細胞内で観察することができたし、5継代後、本質的に未分化コロニーが観察されなかった。 LIF（陽性対照）で処理したコロニーは、5セルの通路を通して未分化状態のまま。 300nm以上は100 nMの濃度でSC1で処理した細胞はまた、しかし、細胞が第四継代後に1μMSC1経験豊富な細胞死で処理、5継代の後に未分化のままであった。 （アプリケーションノートの図2）表1は、形態学的観察結果をまとめたものです。
2。多能性マーカーの発現
5継代維持したマウスES細胞はSSEA1、Oct4の、NanogのとSox2のために固定し、免疫細胞化学によって調べた。マーカーの発現は、LIF内に保持細胞に類似していた。 （アプリケーションノートの図3と4）
図1：LIFまたはSC1に保持されて細胞の形態の比較。形態に差は認められなかった。
図2と図3：Nanogの、SSEA1、レトロウイルスベクター、及びSC1またはLIF（アプリケーションノートの図4）で維持されたES細胞のOct4の染色。 SC1に保持されて細胞はLIFで維持細胞に類似した多能性マーカー発現を示しています。
表1
| 負の制御 | LIFポジティブコントロール | SC1 1uM | SC1 300nMの | SC1 100 nMの | |
| 第一パッセージ | 通常のES細胞の形態 | 通常のES細胞の形態 | 通常のES細胞の形態 | 通常のES細胞の形態 | 通常のES細胞の形態 |
| 第二パッセージ | いくつかの差別化された形態 | 通常のES細胞の形態 | 通常のES細胞の形態 | 通常のES細胞の形態 | 通常のES細胞の形態 |
| 第三パッセージ | 分化した細胞の大部分 | 通常のES細胞の形態 | 通常のES細胞の形態 | 通常のES細胞の形態 | 通常のES細胞の形態 |
| 第四パッセージ | いいえESCコロニーなし | 通常のES細胞の形態 | 観察された細胞死 | 通常のES細胞の形態 | 通常のES細胞の形態 |
| 第五パッセージ | 分化した | 通常のES細胞の形態 | 観察された細胞死 | 通常のES細胞の形態 | 通常のES細胞の形態 |
Discussion
小分子のSC1は、マウスES細胞の未分化状態で自己複製を維持するために使用することができます。テストされていない細胞株で使用する前に、しかし、それは最適な濃度を決定するために滴定する必要があります。例えば、我々はマウスES細胞株ESC R1の3つの濃度をテストした。 100 nMのと300 nMの濃度は、マウスES細胞を維持することができた、しかし、1μMの濃度では毒性を示した。
SC1は、フィーダーを含まない条件下で使用することができます。
Disclosures
この記事の著者は、この記事で使用した試薬と器具を生産するStemgentによって雇用されている。
Acknowledgments
著者は彼らの援助と方向にスクリップス研究所の博士盛鼎と北京大学の博士洪鄧に感謝したい。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SC1 | Stemgent | 04-0011 | |
| LIF | EMD Millipore | ESG1107 | |
| SSEA-1 antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | 21702 | |
| Nanog antibody | Abcam | ab21603 | |
| Sox2 antibody | Chemicon International | Ab5603 | |
| Oct4 antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-5279 |
References
- Williams, R. L., Hilton, D. J., Pease, S., Willson, T. A., Stewart, C. L., Gearing, D. P., Wagner, E. F., Metcalf, D., Nicola, N. A., Gough, N. M. Myeloid leukaemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells. Nature. 336, 684-687 (1988).
- Ying, Q. L., Wray, J., Nichols, J., Batlle-Morera, L., Doble, B., Woodgett, J., Cohen, P., Smith, A. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature. 453, 519-523 (2008).
- Chen, S., Do, J. T., Zhang, Q., Yao, S., Yan, F., Peters, E. C., Scholer, H. R., Schultz, P. G., Ding, S. Self-renewal of embryonic stem cells by a small molecule. Proc. Natl. Acat. Sci. USA. 103, 17266-17271 (2006).
