Användningen av SC1 (Pluripotin) för att stödja Mesc självförnyelse i frånvaro av LIF

Summary

SC1 fungerar genom dubbla hämning av Ras-GAP och ERK1. Vi testade funktionen av SC1 att stödja cell mus ES självförnyelse i avsaknad av LIF och visade att SC1 kan bibehålla självförnyelse av cell musen ES kulturer.

Abstract

Mus embryonala stamceller (ES-celler) är konventionellt odlade med leukemi hämmande faktor (LIF) för att upprätthålla självförnyelse.

Protocol

1. Beredning av MEF matare plattor

1. En dag innan cellerna odling ES, tina en flaska av bestrålat E14.5 CF-1 MEF feeder celler (se vårt förfarande om hur man tina ES-celler).
2. Tavla MEF mataren celler med en täthet på 10.000 celler / brunn i en 12 brunnar. Inkubera cellerna över natten vid 37 ° C och 5% CO _2. MEF celler media: DMEM kompletteras med 10% ES-PBS, 1X glutamin och 1X icke-essentiella aminosyror.

2. Underhåll av självförnyelse av Mouse ES-celler

1. Lossa ES-celler med hjälp av trypsin. Seed på celler med en täthet på 50.000 celler / brunn på den tidigare beredda plattorna MEF matare i tillväxt media (Knockout MEM kompletteras med 15% KSR, 4 mm L-glutamin, 0,1 mM icke-essentiella aminosyror och 1X BME) kompletteras med SC1 på önskad koncentration (vi använde 100 nm, 300 nm och 1 M). Vi lade också till en positiv kontroll brunn som kompletterades med 1000 μ / ml i LIF. Inkubera cellerna över natten vid 37 ° C och 5% CO _2.
2. Kultur cellerna vid 37 ° C och 5% CO ₂ i 3-4 dagar i varje passage. Uppdatera media varje 48 timmar.
3. Passage celler från 1:10 till 1:15 med trypsin att upprätthålla en liknande täthet som den ursprungliga sådd densitet. Efter 5 passager, kan cellerna undersökas för uttrycket av typiska pluripotens markörer med hjälp av immuncytokemi.

3. Immuncytokemiska Undersökning av pluripotens Markörer

1. Tvätta cellerna försiktigt tre gånger med PBS.
2. Fixera cellerna med 500 ìl fixativ i 20 minuter i rumstemperatur.
3. Tvätta cellerna försiktigt tre gånger med PBS.
4. Blockera icke-specifik bindning med 500 l blockerande buffert i en timme vid rumstemperatur.
5. Inkubera cellerna med 250 l av de specifika primära antikroppen (vi använde NANOG, Sox2, SSEA1 och Oct4 på följande spädningar: 1:500, 1:2000, 1:500 och 1:500)
6. Tvätta cellerna försiktigt tre gånger med PBS.
7. Inkubera cellerna med 250 l av sekundära antikroppar i två timmar i rumstemperatur, hålla borta från ljus (vi använde åsna anti-mus-konjugerat med Alexa Fluor ® 555 på 1:2000 och åsna anti-kanin konjugerat med Alexa Fluor ® 488 vid 1 : 2000).
8. Tvätta cellerna försiktigt tre gånger med PBS.
9. Lägg DAPI (slutlig koncentration 1 mikrogram / ml) till den sista tvättningen och inkubera 5 minuter att visualisera kärnor.
10. Analysera cellerna under ett fluorescerande mikroskop.

4. Representativa resultat:

1. Morfologi resultat:

Mus ES-celler (ESC R1) odlades på MEF matare celler i närvaro av antingen LIF eller SC1 att upprätthålla självförnyelse på en odifferentierad stat. Efter den andra passagen kunde differentiering observeras i celler utan LIF eller SC1 (negativ kontroll) och efter 5 passager princip ingen odifferentierade kolonier observerades. LIF (positiv kontroll) behandlade bisamhällena kvar i en odifferentierad staten under 5 cellen passager. Celler som behandlats med SC1 vid koncentrationer på 300 Nm eller 100 nM också varit odifferentierade efter 5 stycken, men de celler som behandlats med 1 mikroM SC1 erfarna celldöd efter den fjärde passagen. (Fig 2 med ca not) I tabell 1 sammanfattas morfologiska observationer.

2. Redovisning av pluripotens Markörer

Mus ES-celler bibehållas under 5 passager fastställdes och granskas av immuncytokemi för SSEA1, Oct4, NANOG och Sox2. Marker uttryck liknade cellerna upprätthålls i LIF. (Fig 3 och 4 i app anmärkning)

Figur 1: morfologi jämförelse av celler kvar i LIF eller SC1. Ingen skillnad i morfologi observerades.

Figur 2 och Figur 3: NANOG, SSEA1, Sox2 och Oct4 färgning av ES-celler upprätthålls med SC1 eller LIF (fig 4 av app anmärkning). Celler hållas i SC1 visar liknande pluripotens markör uttryck för att cellerna upprätthålls i LIF.

Tabell 1

	Negativ kontroll	LIF positiv kontroll	SC1 1um	SC1 300 nm	SC1 100 nM
1:a Passage	Normal ES cellmorfologin	Normal ES cellmorfologin	Normal ES cellmorfologin	Normal ES cellmorfologin	Normal ES cellmorfologin
2:a Passage	Vissa differentierade morfologi	Normal ES cellmorfologin	Normal ES cellmorfologin	Normal ES cellmorfologin	Normal ES cellmorfologin
3:e Passage	Majoritet av differentierade celler	Normal ES cellmorfologin	Normal ES cellmorfologin	Normal ES cellmorfologin	Normal ES cellmorfologin
4:e Passage	Inga ESC kolonier	Normal ES cellmorfologin	Celldöd som observerats	Normal ES cellmorfologin	Normal ES cellmorfologin
5:e Passage	differentierade	Normal ES cellmorfologin	Celldöd som observerats	Normal ES cellmorfologin	Normal ES cellmorfologin

Discussion

Den lilla molekylen SC1 kan användas för att upprätthålla självförnyelse med en odifferentierad stat i mus ES-celler. Innan du använder på ett oprövat cellinje, bör det dock vara titreras för att bestämma den optimala koncentrationen. Till exempel, testade vi tre koncentrationer på musen ES cellinje ESC R1. 100 nm och 300 koncentrationer nM kunde upprätthålla celler mus ES, var dock en 1 mikroM koncentration giftiga.

SC1 kan även användas under feeder-fri förhållanden.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
SC1	Stemgent	04-0011
LIF	EMD Millipore	ESG1107
SSEA-1 antibody	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	21702
Nanog antibody	Abcam	ab21603
Sox2 antibody	Chemicon International	Ab5603
Oct4 antibody	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	SC-5279