Het gebruik van SC1 (Pluripotin) naar Mesc Zelfvernieuwing Ondersteuning bij de afwezigheid van LIF

Summary

SC1 functies door dubbele remming van Ras-GAP en ERK1. We testten de functie van SC1 in de ondersteuning van muis ES-cel zelf-vernieuwing in de afwezigheid van LIF en liet zien dat SC1 in staat is om zelf-vernieuwing van de muis ES-celculturen te behouden.

Abstract

Muis embryonale stamcellen (ES)-cellen zijn conventioneel gekweekt met Leukemie-remmende factor (LIF) om zelf-vernieuwing te behouden.

Protocol

1. Voorbereiding van de MEF feeder platen

1. Een dag voor het kweken van embryonale stamcellen, dooi een flacon van bestraalde E14.5 CF-1 MEF feeder-cellen (zie onze procedure voor het ES-cellen ontdooien).
2. Het bord van de MEF feeder-cellen bij een dichtheid van 10.000 cellen / putje in een 12 wells plaat. Incubeer de cellen gedurende de nacht bij 37 ° C en 5% CO _2. MEF cel media: DMEM aangevuld met 10% ES-PBS, 1X glutamine en 1X niet-essentiële aminozuren.

2. Onderhoud van Self-Vernieuwing van muis ES cellen

1. Maak de ES-cellen met behulp van trypsine. Zaad van de cellen bij een dichtheid van 50.000 cellen / goed op de vooraf bereide MEF feeder platen in de groei media (Knockout MEM aangevuld met 15% KSR, 4 mM L-glutamine, 0,1 mM niet-essentiële aminozuren en 1X BME), aangevuld met SC1 op de gewenste concentratie (gebruikten we 100 nM, 300 nM, en 1 uM). We hebben ook nog een positieve controle goed, dat werd aangevuld met 1000 μ / ml LIF. Incubeer de cellen gedurende de nacht bij 37 ° C en 5% CO _2.
2. Cultuur de cellen bij 37 ° C en 5% CO ₂ voor 3-4 dagen per passage. Refresh media om de 48 uur.
3. Passage cellen 1:10-tot-1:15 met trypsine om een ​​soortgelijke dichtheid als de eerste seeding dichtheid te behouden. Na vijf passages, kunnen de cellen worden onderzocht voor de expressie van de typische pluripotentie markers met behulp van immunocytochemie.

3. Immunocytochemische Onderzoek van pluripotentie Markers

1. Was de cellen voorzichtig drie keer met PBS.
2. Fixeer de cellen met 500 pi van fixatief gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.
3. Was de cellen voorzichtig drie keer met PBS.
4. Blokkeer niet-specifieke binding met 500 ul blokkeerbuffer gedurende een uur bij kamertemperatuur.
5. Incubeer de cellen met 250 pi van de specifieke primaire antilichaam (wij gebruikten NANOG, Sox2, SSEA1, en Oct4 op de volgende verdunningen: 1:500, 1:2000, 1:500 en 1:500)
6. Was de cellen voorzichtig drie keer met PBS.
7. Incubeer de cellen met 250 ul van secundaire antilichaam voor twee uur bij kamertemperatuur, waardoor uit de buurt van licht (wij gebruikten ezel anti-muis-geconjugeerd met Alexa Fluor ® 555 bij 1:2000 en ezel anti-konijn geconjugeerd met Alexa Fluor ® 488 op 1 : 2000).
8. Was de cellen voorzichtig drie keer met PBS.
9. Voeg DAPI (eindconcentratie 1 ug / ml) tot de laatste wassen en incubeer 5 minuten kernen te visualiseren.
10. Analyseer de cellen onder een fluorescentiemicroscoop.

4. Representatieve resultaten:

1. Morfologie resultaten:

Muis ES-cellen (ESC R1) werden gekweekt op MEF feeder cellen in de aanwezigheid van een van beide LIF of SC1 om zelf-vernieuwing te ondersteunen in een ongedifferentieerde staat. Na de tweede passage, kan onderscheid worden waargenomen in cellen zonder LIF of SC1 (negatieve controle) en na vijf passages in wezen geen ongedifferentieerde kolonies werden waargenomen. LIF (positieve controle) behandeld kolonies bleven in een ongedifferentieerde staat gedurende de 5 cel passages. Cellen behandeld met SC1 bij concentraties van 300 nM of 100 nM ook ongedifferentieerde bleef na vijf passages, maar de cellen behandeld met 1 uM SC1 ervaren celdood na de vierde passage. (Fig. 2 van de app note) Tabel 1 geeft een overzicht van de morfologische waarnemingen.

2. Expressie van pluripotentie Markers

Muis ES-cellen gedurende vijf passages waren vastgesteld en onderzocht door middel van immunocytochemie voor SSEA1, Oct4, NANOG en Sox2. Marker uitdrukking was gelijk aan cellen behouden in LIF. (Fig 3 en 4 van app noot)

Figuur 1: Morfologie vergelijking van de cellen die gehandhaafd in LIF of SC1. Geen verschil in morfologie waargenomen.

Figuur 2 en Figuur 3: NANOG, SSEA1, Sox2 en Oct4 kleuring van ES-cellen onderhouden met SC1 of LIF (fig 4 van ca. noot). Cellen gehandhaafd in SC1 Toon vergelijkbaar pluripotentie marker expressie aan cellen behouden in LIF.

Tabel 1

	Negatieve controle	LIF positieve controle	SC1 1uM	SC1 300 nM	SC1 100 nM
1e Passage	Normale ES-cel morfologie	Normale ES-cel morfologie	Normale ES-cel morfologie	Normale ES-cel morfologie	Normale ES-cel morfologie
2e Passage	Sommige gedifferentieerde morfologie	Normaal ES celmorfologie	Normale ES-cel morfologie	Normale ES-cel morfologie	Normale ES-cel morfologie
3e Passage	Meerderheid van de gedifferentieerde cellen	Normale ES-cel morfologie	Normale ES-cel morfologie	Normale ES-cel morfologie	Normale ES-cel morfologie
4e Passage	Geen ESC kolonies	Normale ES-cel morfologie	Celdood waargenomen	Normale ES-cel morfologie	Normale ES-cel morfologie
5e Passage	gedifferentieerd	Normale ES-cel morfologie	Celdood waargenomen	Normale ES-cel morfologie	Normale ES-cel morfologie

Discussion

De kleine molecule SC1 kan worden gebruikt om zelf-vernieuwing te onderhouden met een ongedifferentieerde staat in de muis ES-cellen. Bij gebruik op een niet-geteste cellijn, echter, moet worden getitreerd tot de optimale concentratie te bepalen. Bijvoorbeeld, we getest drie concentraties op de muis ES-cellijn ESC R1. 100 nM en 300 nM waren de concentraties in staat om de muis ES cellen te ondersteunen, maar een 1 uM concentratie giftig.

SC1 kan ook worden gebruikt onder feeder-vrije omstandigheden.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
SC1	Stemgent	04-0011
LIF	EMD Millipore	ESG1107
SSEA-1 antibody	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	21702
Nanog antibody	Abcam	ab21603
Sox2 antibody	Chemicon International	Ab5603
Oct4 antibody	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	SC-5279