Summary
SC1 라스 - GAP 및 ERK1의 이중 억제를 통해 기능을 수행합니다. 우리는 난생의 부재에서 마우스 ES 세포 자기 갱신을 지원 SC1의 기능을 테스트하고 SC1은 마우스 ES 세포 배양의 자기 갱신을 유지할 수 있는지 보여주었다.
Abstract
마우스 배아 줄기 (ES) 세포는 통상 자기 갱신을 유지하기 위해 백혈병 억제 팩터 (난생)와 양식입니다.
Protocol
1. MEF 피더 플레이트의 준비
- culturing의 ES 세포 전에 하루의 해동 한 병을 조사 E14.5 CF - 1 MEF의 피더 세포 (ES 세포를 해동하는 방법에 대한 절차를 참조).
- 10000 세포의 밀도에 플레이트 MEF 피더 셀 / 물론 12 잘 플레이트 인치 37 ° C와 5% CO 2 밤새 세포를 품어. MEF 세포 미디어 : DMEM 10 % ES - PBS, 1X 및 1X 글루타민이 아닌 필수 아미노산과 보충.
2. 마우스 ES 세포 자기 갱신의 유지 관리
- 트립신을 사용하여 ES 세포를 분리합니다. / 잘 성장 미디어에 이전에 준비 MEF 피더 플레이트 (마네의 멤은 15 % KSR, 4 MM의 L - 글루타민, 0.1 MM 아닌 필수 아미노산과 1X BME와 보충)에 50,000의 세포 밀도에 씨앗 세포가 SC1과 보충 원하는 농도에서 (우리는 100 nm의, 300 NM, 1 μm의 사용). 우리는 또한 1,000 μ / 평범한의 ML과 보충했습니다 잘 긍정적인 컨트롤을 추가했습니다. 37 ° C와 5% CO 2 밤새 세포를 품어.
- 문화 37 세포 ° C와 5% 각 구절에서 3~4일에 대한 CO 2. 새로고침 미디어마다 48시간.
- 패시지 세포 초기 시딩 밀도로 유사한 밀도를 유지하는 트립신과 1시 10분에서 1시 15분까지. 5 구절 후, 세포가 immunocytochemistry를 사용하는 전형적인 pluripotency 마커의 표현에 대한 검사 수 있습니다.
3. Pluripotency 마커 Immunocytochemical 시험
- 세포에게 PBS로 가볍게 세 번 씻으십시오.
- 실온에서 20 분 정착액 500 μl와 세포를 수정.
- 세포에게 PBS로 가볍게 세 번 씻으십시오.
- 상온에 한 시간 동안 500 μl 차단 버퍼가 아닌 특정 바인딩을 차단합니다.
- 특정 차 항체 250 μl (1:500, 1:2000, 1:500, 1:500 그리고 우리가 다음 dilutions에서 Nanog, Sox2, SSEA1, 그리고 Oct4를 사용)으로 세포를 품어
- 세포에게 PBS로 가볍게 세 번 씻으십시오.
- (우리가 1 1:2000과 동키의 알렉사 플루어 ® 488과 안티 - 토끼 복합에서 알렉사 플루어와 안티 - 마우스 복합 ® 555 당나귀를 사용하여 빛으로부터 멀리 보관, 상온에서 두 시간 동안 이차 항체 250 μl와 세포를 품어 : 2000).
- 세포에게 PBS로 가볍게 세 번 씻으십시오.
- 마지막으로 씻어 DAPI를 (최종 농도가 1 μg / ML) 추가하고 핵을 시각화하기 위해 5 분 알을 품다.
- 형광 현미경으로 세포를 분석합니다.
4. 대표 결과 :
1. 형태 결과 :
마우스 ES 세포 (ESC R1)가 undifferentiated 상태에서 자기 갱신을 유지하기 위해 난생 또는 SC1 중의 면전에서 MEF 피더 세포에서 성장했다. 두 번째 통로 후, 차별화는 평범한 또는 SC1 (대조군)하지 않고 세포에서 관찰 될 수있는 5 구절 후 본질적으로 아무런 undifferentiated 식민지는 관찰되지 않았습니다. 난생 (긍정적인 제어) 처리 식민지는 5 세포 통로를 통해 undifferentiated 상태에 있었다. 300 NM 또는 100 nm의의 농도에서 SC1로 치료 세포도 다섯 구절 후 undifferentiated 남아 그러나, 세포는 네 번째 통로 후 1 μm의 SC1 경험이 세포 죽음으로 취급. (애플 리케이션 노트 그림 2) 표 1은 형태학의 관찰을 요약한 것입니다.
2. Pluripotency 마커 표현
5 구절에 대한 유지 마우스 ES 세포는 SSEA1, Oct4, Nanog와 Sox2에 대한 고정 및 immunocytochemistry에 의해 조사되었다. 마커 표현이 평범한 유지 세포와 유사했다. (애플 리케이션 노트의 그림 3과 4)
그림 1 : 난생 또는 SC1 유지 세포의 형태론 비교. 형태에 차이는 관찰되지 않았습니다.
그림 2와 그림 3 : Nanog, SSEA1, Sox2, 그리고 SC1 또는 평범한 (애플 리케이션 노트의 그림 4) 유지 ES 세포의 Oct4 염색법. SC1 유지 전지는 평범한 유지 세포와 유사한 pluripotency 표시자 표현을 보여줍니다.
표 1
| 대조군 | 평범한 긍정적인 제어 | SC1 1uM | SC1 300 NM | SC1 100 NM | |
| 첫째 패시지 | 일반 ES 세포 형태 | 일반 ES 세포 형태 | 일반 ES 세포 형태 | 일반 ES 세포 형태 | 일반 ES 세포 형태 |
| 둘째 패시지 | 어떤 차별 형태 | 일반 ES 셀 형태 | 일반 ES 세포 형태 | 일반 ES 세포 형태 | 일반 ES 세포 형태 |
| 셋째 패시지 | 차별화된 세포의 대부분 | 일반 ES 세포 형태 | 일반 ES 세포 형태 | 일반 ES 세포 형태 | 일반 ES 세포 형태 |
| 넷째 패시지 | 아무 ESC 식민지 없음 | 일반 ES 세포 형태 | 세포 죽음은 관찰 | 일반 ES 세포 형태 | 일반 ES 세포 형태 |
| 다섯째 패시지 | 차별 | 일반 ES 세포 형태 | 세포 죽음은 관찰 | 일반 ES 세포 형태 | 일반 ES 세포 형태 |
Discussion
작은 분자 SC1은 마우스 ES 세포에서 undifferentiated 상태와 자기 갱신을 유지하는 데 사용할 수 있습니다. 안된 세포 라인에 사용하기 전에, 그러나, 그것은 최적의 농도를 결정하기 위해 titrated해야합니다. 예를 들어, 마우스 ES 세포 라인 ESC R1 세 농도를 테스트. 100 nm의 300 나노미터 농도가 마우스 ES 세포를 유지 수 있었던 것은, 그러나, 1 μm의 농도가 독성이되었다.
SC1 또한 피더 무료 조건에서 사용할 수 있습니다.
Disclosures
이 문서의 저자는이 문서에서 사용되는 시약 및 악기를 생산 Stemgent 고용하고 있습니다.
Acknowledgments
저자는 그들의 지원과 방향에 대한 스크립스 연구소의 박사 Sheng 딩과 북경 대학의 박사 Hongkui Deng 감사하고 싶습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SC1 | Stemgent | 04-0011 | |
| LIF | EMD Millipore | ESG1107 | |
| SSEA-1 antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | 21702 | |
| Nanog antibody | Abcam | ab21603 | |
| Sox2 antibody | Chemicon International | Ab5603 | |
| Oct4 antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-5279 |
References
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- Ying, Q. L., Wray, J., Nichols, J., Batlle-Morera, L., Doble, B., Woodgett, J., Cohen, P., Smith, A. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature. 453, 519-523 (2008).
- Chen, S., Do, J. T., Zhang, Q., Yao, S., Yan, F., Peters, E. C., Scholer, H. R., Schultz, P. G., Ding, S. Self-renewal of embryonic stem cells by a small molecule. Proc. Natl. Acat. Sci. USA. 103, 17266-17271 (2006).
