Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Kendini yenileme LIF Yokluğunda Mesc Destek SC1 (Pluripotin) kullanımı

Published: November 18, 2009 doi: 10.3791/1550
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 2, 1
1Research and Development, Stemgent, 2Product Marketing, Stemgent

Summary

Ras-GAP ve ERK1 çift inhibisyonu yoluyla SC1 fonksiyonları. Biz LIF yokluğunda fare ES hücre kendini yenileme destekleyen SC1 fonksiyonu test edilmiş ve SC1 fare ES hücre kültürleri kendini yenileme korumak mümkün olduğunu göstermiştir.

Abstract

Fare embriyonik kök (ES) hücreleri, geleneksel olarak kendini yenileme korumak için lösemi inhibitör faktörü (LIF) ile kültüre.

Protocol

1. MEF besleyici tabak hazırlanması

  1. Kültür ES hücrelerinin bir gün önce, bir çözülme bir flakon ışınlanmış E14.5 CF-1 MEF besleyici hücreler (ES hücrelerinin nasıl Çözülme yordama bakın).
  2. 10.000 hücrelerinin yoğunluğu Plaka MEF besleyici hücreler / 12 plaka. 37 ° C ve% 5 CO 2 geceleme hücreleri inkübe edin. MEF hücre medya: DMEM% 10 ES-PBS, 1X glutamin ve 1X non-esansiyel amino asitleri ile desteklenmiştir.

2. Kendinden Fare ES Hücre Yenileyici Bakım

  1. Tripsin kullanarak ES hücreleri ayırın. / Iyi büyüme ortamı önceden hazırlanmış MEF besleyici plakaları (Nakavt MEM,% 15 KSR, 4 mM L-glutamin, 0.1 mM non-esansiyel amino asitler ve 1X BME ile desteklenmiş) 50.000 hücrelerinin yoğunluğu Tohum hücreleri SC1 ile desteklenmiş istenilen konsantrasyonda (100 nM 300 nM ve 1 mcM). Ayrıca 1000 μ / ml LIF ile desteklenmiş iyi bir pozitif kontrol ekledi. 37 ° C ve% 5 CO 2 geceleme hücreleri inkübe edin.
  2. Kültür 37 hücreleri ° C ve% 5 CO 2 3-4 gün için her pasajda. Yenile medya her 48 saatte.
  3. Passage hücreleri ilk tohumlama yoğunluğu gibi benzer bir yoğunluğunu korumak için tripsin ile 1:10 - 1:15. 5 pasajlar sonra, hücreler tipik pluripotency belirteçlerin immünsitokimya kullanarak ifade için incelenebilir.

3. Pluripotency Belirteçleri İmmünositokimyasal Sınav

  1. Hücreler PBS ile hafifçe üç kez yıkayın.
  2. 500 oda sıcaklığında 20 dakika fiksatif ul hücreleri sabitleyin.
  3. Hücreler PBS ile hafifçe üç kez yıkayın.
  4. Oda sıcaklığında bir saat için 500 ul engelleme tampon ile non-spesifik bağlama engelleyin.
  5. 250 ul spesifik primer antikor (1:500, 1:2000, 1:500, 1:500 aşağıdaki dilüsyonları Nanog, Sox2, SSEA1 ve Oct4) hücreleri inkübe
  6. Hücreler PBS ile hafifçe üç kez yıkayın.
  7. (1 1:2000 ve eşek Alexa Fluor ® 488 anti-tavşan konjuge anti-fare Alexa Fluor konjuge ® 555 eşek kullanılan ışıktan uzak tutarak, ikincil antikor 250 ul hücreleri iki saat oda sıcaklığında inkübe edin. : 2000).
  8. Hücreler PBS ile hafifçe üç kez yıkayın.
  9. Son yıkama DAPI (son konsantrasyonu 1 mcg / ml) ve çekirdekleri görselleştirmek için 5 dakika inkübe edin.
  10. Floresan mikroskop altında hücrelerin analiz edin.

4. Temsilcisi Sonuçlar:

1. Morfoloji sonuçları:

Fare ES hücrelerinin (ESC R1), farklılaşmamış bir halde kendini yenileme sürdürmek için ya LIF veya SC1 varlığı MEF besleyici hücreler yetişen. Ikinci geçit sonra LIF veya SC1 (negatif kontrol) olmadan, farklılaşma hücrelerinde gözlenen olabilir ve 5 pasajlar sonra aslında hiç farklılaşmamış koloniler gözlenmiştir. LIF (pozitif kontrol) tedavi koloniler 5 hücre pasajlar boyunca farklılaşmamış bir devlet kaldı. 300 nm veya 100 nM konsantrasyonlarda SC1 ile tedavi Hücreler aynı zamanda 5 pasajlar sonra farklılaşmamış kaldı, ancak, hücrelerin dördüncü geçtikten sonra 1 mcM SC1 deneyimli hücre ölümü ile tedavi. (App not şekil 2) Tablo 1 gözlemler özetlenmiştir.

2. Pluripotency Markers İfadesi

5 pasajlar sürdürülen Fare ES hücrelerinin SSEA1, Oct4, Nanog ve Sox2 için sabit ve immünsitokimya tarafından incelendi. Marker ifade LIF muhafaza hücreleri için benzer. (App not şekil 3 ve 4)

Şekil 1
Şekil 1: LIF veya SC1 muhafaza hücreleri Morfoloji karşılaştırılması. Morfoloji açısından fark yok gözlendi.

Şekil 2 ve 3
Şekil 2 ve Şekil 3: Nanog, SSEA1, Sox2 ve bakımı, SC1 veya LIF (app not şekil 4) ile ES hücrelerinin Oct4 boyama . SC1 olarak tutulan hücreler LIF muhafaza hücreleri için benzer pluripotency işaretleyici ifade göstermektedir.

Tablo 1

Negatif Kontrol LIF Pozitif Kontrolü SC1 1uM SC1 300 Nm SC1 100 Nm
1. Passage Normal ES hücre morfolojisi Normal ES hücre morfolojisi Normal ES hücre morfolojisi Normal ES hücre morfolojisi Normal ES hücre morfolojisi
2. Passage Bazı farklılaştırılmış morfolojisi Normal DS hücre morfolojisi Normal ES hücre morfolojisi Normal ES hücre morfolojisi Normal ES hücre morfolojisi
3. Passage Farklılaşmış hücrelerin büyük bir çoğunluğu Normal ES hücre morfolojisi Normal ES hücre morfolojisi Normal ES hücre morfolojisi Normal ES hücre morfolojisi
4. Passage Yok ESC koloniler Normal ES hücre morfolojisi Hücre ölümü gözlenen Normal ES hücre morfolojisi Normal ES hücre morfolojisi
5. Passage farklılaştırılmış Normal ES hücre morfolojisi Hücre ölümü gözlenen Normal ES hücre morfolojisi Normal ES hücre morfolojisi

Discussion

Küçük molekül SC1 fare ES hücreleri farklılaşmamış bir devlet ile kendini yenileme korumak için kullanılabilir. Ancak, denenmemiş bir hücre hattı kullanmadan önce, optimal konsantrasyonunu belirlemek için titre edilmelidir. Örneğin, fare ES hücre hattı ESC R1 üç konsantrasyonları test etti. 100 nM ve 300 nM konsantrasyonlarda fare ES hücrelerinin sürdürmek başardık, ancak 1 mcM konsantrasyonu toksik oldu.

SC1 aynı zamanda besleyici-koşullar altında kullanılabilir.

Disclosures

Bu makalenin yazarları, bu yazıda kullanılan reaktifler ve aletleri üreten Stemgent tarafından istihdam edilmektedir.

Acknowledgments

Scripps Araştırma Enstitüsü'nden Dr. Sheng Ding ve Pekin Üniversitesi Dr. HongKui Deng yazarlar, onların yardım ve yön için teşekkür etmek istiyorum.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SC1 Stemgent 04-0011
LIF EMD Millipore ESG1107
SSEA-1 antibody Santa Cruz Biotechnology, Inc. 21702
Nanog antibody Abcam ab21603
Sox2 antibody Chemicon International Ab5603
Oct4 antibody Santa Cruz Biotechnology, Inc. SC-5279

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Williams, R. L., Hilton, D. J., Pease, S., Willson, T. A., Stewart, C. L., Gearing, D. P., Wagner, E. F., Metcalf, D., Nicola, N. A., Gough, N. M. Myeloid leukaemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells. Nature. 336, 684-687 (1988).
  2. Ying, Q. L., Wray, J., Nichols, J., Batlle-Morera, L., Doble, B., Woodgett, J., Cohen, P., Smith, A. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature. 453, 519-523 (2008).
  3. Chen, S., Do, J. T., Zhang, Q., Yao, S., Yan, F., Peters, E. C., Scholer, H. R., Schultz, P. G., Ding, S. Self-renewal of embryonic stem cells by a small molecule. Proc. Natl. Acat. Sci. USA. 103, 17266-17271 (2006).

Tags

Hücresel Biyoloji Sayı 33 SC1 (Pluripotin) LIF Mesc ESC fare fare ES hücrelerinin pluripotency kendini yenileme küçük molekül
Kendini yenileme LIF Yokluğunda Mesc Destek SC1 (Pluripotin) kullanımı
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Xiong, W., Gao, Y., Cheng, X.,… More

Xiong, W., Gao, Y., Cheng, X., Martin, C., Wu, D., Yao, S., Kim, M., Liu, Y. The use of SC1 (Pluripotin) to Support mESC Self-renewal in the Absence of LIF. J. Vis. Exp. (33), e1550, doi:10.3791/1550 (2009).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter