בידוד והשתלות של בתאי גזע hematopoietic (HSCs)

Summary

Protocol

סך מח עצם הכנת

1. ארבעה עכברים B6 הם הקריבו גזור להשיג tibias, עצמות הירך, האגן ועמוד השדרה.
2. במהלך והניתוחים, הגפיים ועצמות נשמרים PBS 2% FCS מומת חום (אופציונלי 2mm EDA - בינוני דיסקציה).
3. העצמות הן נקיות כתוש עם מכתש ועלי במדיום לנתיחה. הדרך היעילה לעשות זאת היא לרסק tibias, עצמות הירך והירכיים של כל עכבר, אז 2 קוצים בכל פעם.
4. תערובת התא המתקבל העכבר כל הזמן נפרדים מסונן דרך מסנן 40μm לתוך צינור בז 50 מ"ל. בדרך זו, כל שפופרת מכילה את התערובת תא שהושגו מתוך כל עצמות רגל של עכבר, וחצי של התערובת המתקבלת 2 קוצים. בשלב זה, המסנן משמש להפריד פסולת העצם.
5. זה בדרך כלל מומלץ לרסק את עצמות הרגל פעמיים כדי לקבל לבן (עם מח עצם לא), שברי עצמות, ואת שברי עמוד השדרה 2 או 3 פעמים.
6. ממלאים את צינורות יש להם מאוזנת, ספין 5 דקות 1200rpm.
7. לשאוב supernatant ו לשחרר את גלולה ידי גרירת צינורות על המדף צינור (שלב זה חשוב אחרי כל צנטריפוגה כדי למזער היווצרות גוש ואובדן התא). Resuspend כל הצינורית 1 מ"ל PBS FCS 2% (NO EDTA מעתה והלאה) אם אתה עושה דלדול השושלת, או בכל אמצעי אחסון אחרת הנוחה לך.

Lineage דלדול

1. הליך זה מאפשר לך לחסל תאים מובחנים מאוד ולקבל אוכלוסייה הטרוגנית מאוד של תאים, המועשר בתאי גזע אב. אם אתה מיון HSC, צעד זה מפחית באופן דרסטי את מספר התאים כי צריך לעבור מיון התא, ולכן צמצום זמן מיון המאפשר לכם למיין HSC מתוך מספר גבוה יותר של עכברים, כך שתוכל להשיג מספר גבוה יותר של HSC במיון אחד.
2. אם אתה הולך למיין מאוחר יותר, להוציא 50μl תערובת תאים (אני בדרך כלל לוקח קצת מהצינור אחד) למיון שולטת (בלא כתם ו Sca1, c-Kit, CD48, Flk2 צבע שולט יחיד).
3. הוסף 30ml/tube לין קוקטייל. קוקטייל Lineage מכיל מגוון של נוגדנים, שלמרבה הצער שינויים קצת מן המעבדה למעבדה. במעבדה Scadden, אנו משתמשים נוגדנים נגד biotinilated Gr1, Ter119, CD4, CD8, CD3, B220. הדילול הסופי שלהם ב מכתים הוא 1:700.
4. וורטקס במהירות לערבב דגירה במשך 15 דקות ב 4 ° C.
5. במהלך הדגירה, להכין את העמודות על מגנטים וצינורות elution 15ml תחת העמודות. דגה PBS כמה באמצעות מסנן steriflip (אתה אמור לראות בועות אוויר קטנות נעות לעבר פני השטח של PBS בשל השאיפה ואקום), וכן לאזן את העמודות על ידי יישום PBS degassed 3ml כל עמודה.
6. זרימת טור הוא כ 1ml/5min, אז זה לוקח בערך 15 דקות כדי לקבל את העמודות מוכן לשימוש.
7. בסוף הדגירה, מוסיפים PBS 2% FCS כדי למלא את צינורות ספין למטה 5 דקות על 1200rpm.
8. לשאוב supernatant, לשחרר את כדורי ואת resuspend ב מ"ל 1 / צינור degassed PBS.
9. אם אתה מיון מאוחר יותר, להוציא מח עצם הכולל Lineage אחד מכתים צבע ctrl (15 מ"ל, קצת מהצינור כל אחד).
10. הוסף streptavidin חרוזים, 30ml/tube מערבולת במהירות לערבב דגירה במשך 15 דקות ב 4 ° C.
11. בסוף הדגירה, מוסיפים 2 מ"ל / שפופרת של PBS degassed. שים צינורות אוסף חדש תחת העמודים, ולהחיל כל השעיה לעמודה, סינון דרך פילטר 40μm.
12. הוסף 3 מ"ל של PBS degassed על צינור אחד לשטוף אותו. לאחר העמודות ריקות, חלה שוב באמצעות מסנן 40μm אותו.
13. Eluate מכיל השושלת מדולדל תא תערובת, אוכלוסייה הטרוגנית מועשר עבור ותאי גזע אבות. בריכת התוכן של 4 צינורות לתוך 2 צינורות. ספין דקות 5 ב 1500rpm.
14. לשאוב supernatant. גלולה צריך להיות לבן או לבן בעיקר. שחרר את כדורי ואת resuspend אותם יחד 1ml סך PBS FCS 2% אם אתה מיון מאוחר יותר, resuspend אחרת בכל נפח הנוחה לך.

LKS או HSC מיון ארוך טווח

1. קח את השושלת מדולדל אחד מכתים צבע ctrl (15 מ"ל). זה יאפשר לך להעריך את היעילות של דלדול השושלת שלך.
2. תערובת התא למיין הוא מוכתם בצינור 15 מ"ל.

הוספת נוגדנים:

SCA PE-Cy5.5	1: 100	10 מ"ל
ערכת APC	1:100	10 מ"ל
SA PE-Cy7	1:500	2ml

כדי למיין HSC לטווח ארוך, גם להוסיף:

CD48 FITC	1:1000	1ml
Flk2 PE	1:200	5 מ"ל

כמו כן, להכין מכתים אחת שולטת באמצעות מח עצם הכולל שמרו בצד לאחר דיסקציה לבין מח עצם הכולל מוכתם השושלת. Stainings אלה יכול להיעשות ישירות לתוך צינורות FACS.

הקפד להיות בחושך!

1. וורטקס במהירות לערבב דגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך 20 עד 30 דקות, ערבוב מחדש חצי דרך דרך.
2. כדי לשטוף את עודף של נוגדנים, למלא את צינורות עם PBS FCS 2% ספין דקות 5 ב 1500 סל"ד.
3. הסר supernatant, resuspend כל כדורי ולהעביר אותם אל צינורות חדשים FACS עם כובעים הסינון. זה עלול לקחת זמן כדי לקבל את התאים לעבור את המסננים האלה, חשוב ליישם עוד קצת PBS לאחר מכן לשטוף את המסנן ולמזער את אובדן התא. צעד זה נחוץ כדי למנוע סתימת של סדרן, אשר הוא הסיוט הגרוע ביותר של כל משתמש סדרן התא.
4. כאשר חלוקת התאים למתקן מיון התא, הקפד גם להכין צינורית עם PBS 10% HI FCS שבו תאים ייאספו.
5. אם אתה מיון תאים LKS, תקבל אוכלוסיה הטרוגנית המכילה טווח ארוך טווח קצר repopulating אבות HSC ו multipotent. התשואה הממוצעת היא 300,000 LKS מ 4 עכברים.
6. אם השתמשת גם CD48 ואת Flk2 נוגדנים, ניתן להפריד בין האוכלוסייה של HSC לטווח ארוך, לטווח קצר HSC MPP. LT-HSC הם אוכלוסייה נדירה ביותר. התשואה הממוצעת היא כ -50,000 עד 60,000 תאים 4 עכברים.