Isolierung und Transplantation von hämatopoetischen Stammzellen (HSZ)

Summary

Protocol

Insgesamt Knochenmark Vorbereitung

1. Vier B6-Mäuse werden getötet und seziert, um tibias, Oberschenkel, Hüfte und Wirbelsäule zu erhalten.
2. Während der Dissektion, sind die Gliedmaßen und die Knochen in PBS 2% FCS hitzeinaktiviertem gehalten (optional 2mM EDA - Dissektion medium).
3. Die saubere Knochen sind mit Mörser und Stößel in Dissektion Medium zerkleinert. Ein effizienter Weg, es zu tun ist, um tibias, Oberschenkel und Hüften jeder Maus, dann 2 Stacheln zu einem Zeitpunkt, zu vernichten.
4. Die Zelle Mischung aus jeder Maus gewonnen werden getrennt und durch einen 40 um Filter in einen 50 ml Falcon-Röhrchen. Auf diese Weise enthält jedes Rohr die Zelle Mischung aus all den Beinknochen einer Maus, und die Hälfte der Mischung von 2 Stacheln gewonnen wird. In diesem Stadium wird der Filter verwendet werden, um Knochendebris trennen.
5. Es ist normalerweise ratsam, die Beinknochen crush zweimal auf weiß zu erhalten (ohne Knochenmark) Knochenfragmente und der Wirbelsäule Fragmente 2 oder 3 mal.
6. Füllen Sie die Rohre haben sie ausgewogen und Spin 5 min 1200rpm.
7. Den Überstand aspirieren und lösen Sie das Pellet durch Ziehen der Rohre auf der Tube-Rack (dieser Schritt wird nach jeder Zentrifugation zur Klumpenbildung und Zellverlust zu minimieren wichtig). Resuspendieren jedes Röhrchen in 1 ml PBS 2% FCS (NO EDTA von nun an), wenn Sie tun Linie Erschöpfung sind, oder in was auch immer Band ist nichts anderes bequemer für Sie.

Lineage Depletion

1. Dieses Verfahren ermöglicht es Ihnen, hoch differenzierte Zellen zu eliminieren und erhalten eine sehr heterogene Population von Zellen, angereichert für Stamm-und Vorläuferzellen. Wenn Sie Sortierung HSC sind, diesen Schritt reduziert drastisch die Zahl der Zellen, die durch die Zellsortierung gehen, daher reduziert Sortierung Zeit und ermöglicht Ihnen, HSC Art aus einer höheren Anzahl von Mäusen, so dass Sie eine höhere Anzahl von zu erhalten HSC in einer einzigen Sortierung.
2. Wenn Sie vorhaben, später zu sortieren sind, nehmen Sie 50 ul Zell-Mischung (die ich gewöhnlich nehme ein bisschen von jedem Röhrchen) für die Sortierung von Kontrollen (ungefärbt und SCA1, c-Kit, CD48, Flk2 einfarbig Kontrollen).
3. Add Lin Cocktail 30ml/tube. Lineage-Cocktail enthält eine Vielzahl von Antikörpern, die leider ein wenig Veränderungen von Labor zu Labor. In der Scadden Labor verwenden wir biotinylierten Antikörper gegen Gr1, TER119, CD4, CD8, CD3, B220. Ihre Endverdünnung in der Färbung ist 1:700.
4. Vortex schnell zu mischen, und Inkubation für 15 min bei 4 ° C.
5. Während der Inkubation, bereiten Sie die Spalten auf der Magneten und 15ml Elutionsgefässe in den Spalten. Degas einige PBS mit einem Steriflip Filter (Sie sollten wenig Luftblasen dem Weg zur Oberfläche des PBS durch Vakuumaspiration zu sehen), und Äquilibrierung der Säulen durch die Anwendung 3ml entgast PBS zu jeder Spalte.
6. Die Säule fließen etwa 1ml/5min, so dauert es ca. 15 min, um die Spalten einsatzbereit zu haben.
7. Am Ende der Inkubationszeit, fügen PBS 2% FCS zu den Rohren zu füllen und Spin-Down für 5 min bei 1200rpm.
8. Den Überstand aspirieren, lösen Sie die Pellets und resuspendieren in 1 ml / Rohr entgast PBS.
9. Wenn Sie später sortieren sind, nehmen Sie insgesamt Knochenmark Lineage einfarbigen Färbung ctrl (15ml, ein bisschen von jedem Röhrchen).
10. Add Streptavidinbeads 30ml/tube, Wirbel schnell zu mischen, und Inkubation für 15 min bei 4 ° C.
11. Am Ende der Inkubation mit 2 ml / Tube entgastem PBS. Setzen Sie neue Kollektion Röhren unter den Säulen, und gelten für jede Hinausstellung auf eine Spalte, Filtrieren durch ein 40 um-Filter.
12. Fügen Sie weitere 3 ml entgastem PBS in jedes Röhrchen, um es zu waschen. Nachdem die Spalten leer sind, gelten wieder mit den gleichen 40 um Filter.
13. Das Eluat enthält die Linie erschöpft Zellgemisch, eine heterogene Bevölkerung für Stamm-und Vorläuferzellen angereichert. Pool den Inhalt der 4 Röhren in 2 Röhren. Spin für 5 min bei 1500rpm.
14. Saugen Sie den Überstand. Das Pellet sollte weiß oder vorwiegend weiß. Lösen Sie die Pellets und resuspendieren sie zusammen in 1 ml PBS insgesamt 2% FCS, wenn Sie später sortieren, sonst in welcher Lautstärke ist für Sie bequem zu resuspendieren.

LKS-oder langfristig HSC Sortierung

1. Nehmen Sie Linie erschöpft einfarbigen Färbung ctrl (15ml). Dies ermöglicht es Ihnen, die Effizienz Ihrer Linie Erschöpfung zu beurteilen.
2. Die Zelle Mischung zu sortieren ist in der 15ml Tube gefärbt.

Add-Antikörper:

Sca PE-Cy5.5	1: 100	10ml
Kit APC	1:100	10ml
SA PE-Cy7	1:500	2ml

So sortieren Sie langfristig HSC, auch hinzufügen:

CD48 FITC	1:1000	1ml
Flk2 PE	1:200	5ml

Auch bereiten einzelne Färbung Steuerelemente mithilfe des gesamten Knochenmarks beiseite nach der Präparation und die gesamte Knochenmark Linie gefärbt gehalten. Diese Färbungen lassen sich direkt in FACS-Röhrchen durchgeführt werden.

Achten Sie darauf, in der Dunkelheit!

1. Vortex schnell zu mischen und bei 4 ° C für 20 bis 30 Minuten, re-Mischen auf halbem Weg durch inkubieren.
2. Abzuwaschen der Überschuss an Antikörpern, füllen Sie das Röhrchen mit PBS 2% FCS und Spin für 5 min bei 1500 Umdrehungen pro Minute.
3. Überstand entfernen, resuspendieren alle Pellets und verschieben Sie sie auf neue FACS-Röhrchen mit Filter Caps. Es kann eine Weile dauern, um die Zellen zu bekommen, um durch diese Filter zu gehen, und es ist wichtig, um etwas mehr PBS danach gelten, um den Filter zu waschen und zu minimieren Zellverlust. Dieser Schritt ist notwendig, um zu vermeiden das Verstopfen der Sortierer, was der schlimmste Alptraum eines jeden Zellsortierer Benutzer.
4. Bei der Übergabe aus den Zellen in die Zelle Sortieranlage, stellen Sie sicher, bereiten auch ein Rohr mit PBS 10% FCS HALLO, wo die Zellen gesammelt werden.
5. Wenn Sie Sortierung LKS-Zellen sind, erhalten Sie eine heterogene Population, die langfristig und kurzfristig repopulating HSC und multipotente Vorläuferzellen. Eine durchschnittliche Ertrag liegt bei 300.000 LKS von 4 Mäusen.
6. Wenn Sie auch CD48 und Flk2 Antikörper verwendet haben, können Sie separate jeder Population von Langzeit-HSC, kurzfristig HSC und MPP. LT-HSC sind die seltenen Bevölkerung. Eine durchschnittliche Ausbeute beträgt ca. 50.000 bis 60.000 Zellen aus 4 Mäusen.