Summary
Abstract
Les cellules souches hématopoïétiques (CSH) sont une population rare de cellules pluripotentes qui maintiennent toutes les lignées sanguines différenciées à travers la vie d'un organisme. La définition fonctionnelle d'un HSC est une cellule transplantée qui a la capacité de reconstituer toutes les lignées de sang d'un terme bénéficiaires irradiés longtemps. Cette désignation a été créé par des décennies de travail séminal dans les systèmes mammifères. En utilisant la transplantation de cellules hématopoïétiques (HCT) et inverser les manipulations génétiques chez la souris, les facteurs qui sous-tendent la réglementation de la biologie HSC commencent à être dévoilés, mais sont encore largement sous-exploré. Récemment, le poisson zèbre est apparu comme un puissant modèle génétique pour l'étude des vertébrés hématopoïèse. Établir HCT chez le poisson zèbre permettra aux scientifiques d'utiliser les méthodologies à grande échelle de dépistage génétique et chimique disponible dans le poisson-zèbre pour révéler de nouveaux mécanismes qui sous-tendent la réglementation HSC. Dans cet article, nous démontrons une méthode pour effectuer HCT chez le poisson zèbre adulte. Nous montrons la dissection et la préparation de la moelle des reins zebrafish ensemble, le site de l'hématopoïèse adulte dans le poisson zèbre, et l'introduction de ces cellules du donneur dans la circulation des poissons bénéficiaires irradié par injection intracardiaque. De plus, nous décrivons les soins post-transplantation de poissons dans une "unité de soins intensifs" pour augmenter leur santé à long terme. En général, les soins douceur du poisson avant, pendant et après la greffe est essentiel d'augmenter le nombre de poissons qui survivent plus d'un mois suivant la procédure, ce qui est essentiel pour l'évaluation de long terme (<3 mois) la prise de greffe. Les données expérimentales utilisées pour établir ce protocole seront publiés ailleurs. La création de ce protocole permettra à la fusion de la génétique de poisson zèbre à grande échelle et la biologie de greffe.
Protocol
L'irradiation
- Poissons WT Irradier à 25Gy 2 jours avant la transplantation
La dissection du rein
- Sacrifice nombre approprié de donateurs fluorescentes dans tricaïne (~ 100ml 4mg/ml tricaïne / litre d'eau du poisson) (moyenne de 500 000 cellules par les poissons des donateurs)
- Isoler les reins en 0.9x PBS + 5% SVF + 1% Penn streptocoque («PBS +") dans un tube
- Rompre avec une pipette de 1 ml, puis avec une seringue de 10 ml avec 18 1 / 2 aiguilles G
- Transférer dans 50mL conique et remplir avec du PBS +
- Isoler @ 1500rpm 8min
- Répands, Resuspendre le culot en grand volume et filtrer à travers du filtre 40micron
- Isoler @ 1500rpm 8min
- Répands, remettre en suspension dans 1ml de PBS +, transfert à tube Eppendorf
- Pour compter: 10ul de cellules Sol + 90ul bleu trypan (maintenant il est dilué 10X)
- 10ul de cellules Sol + 90ul PBS + (maintenant il est dilué 10X)
- Laisser reposer 5 min, ajouter 10ul deux Sol de chaque côté de hématimètre
- Compter les cellules dans la boîte de grande taille (5x5), compte pour le pourcentage de mort si elles sont significatives
- Cellules / ml = (nombre de cellules) (10 4) (x10 dil. Factor)
Exemple - 60 cellules comptées sur hématimètre est 6000000 cellules totales - Isoler l'échantillon @ 1500rpm 8min
- Calculer le volume de remettre en suspension le culot dans une concentration appropriée pour obtenir des cellules
- 5ul volume total à injecter - 3UL WKM être et 2UL sanguins étant périphériques
- Exemple - 6.000.000 cellules totales ont
voulez transplanter 200.000 cellules par bénéficiaire
20 bénéficiaires ont
veulent 66667 cellules / ul (200 000 cellules / 3UL)
Resuspendre le culot dans 90ul (6.000.000 cellules / 66667 cellules / ul)
seulement besoin d'environ 60ul de ce (x 20recip 3UL)
L'extraction du sang périphérique
- Sacrifice nombre approprié de poissons dans le WT tricaïne (~ 100ml 4mg/ml tricaïne / litre d'eau du poisson) pour le sang porteur (moyenne de 2.000.000 cellules par des bailleurs de fonds)
- Anticoagulant: 1UL diluée (3unit/ul) dans 1ml de PBS +
- Pipette Manteau avec de l'héparine, poignarder travers des branchies avec embout de la pipette, ajouter du sang à la PBS +
- Spin 1500rpm 5min, remettre en suspension dans 1,5 ml
- Spin 1500rpm 5min, remettre en suspension dans 1ml
- Filtrer à travers 40micron filtre
- Compter les cellules comme ci-dessus
- Cellules / ml = (nombre de cellules) (10 4) (x10 dil. Factor)
- Compte de la mort
- Calculer le volume resuspension comme ci-dessus
Injection
- Injecter 5ul dans le cœur de chaque destinataire à l'aide d'une seringue Hamilton
- Anesthetize poissons dans tricaïne (4,2 ml (4mg/ml) les poissons d'eau tricaïne / 100ml) et le placer sur une éponge humide
- Insérer le bout un peu en arrière du cœur
- Furetez dans la région du cœur jusqu'à ce que vous voyez un éclat un peu de sang (ce qui signifie que vous a frappé le cœur) -> ne pas voir cela, mais tout de même d'injecter
Soins intensifs de poissons - post-injection
- Gardez le poisson hors de débit pour 1 semaine pour éviter l'infection
- Mettre le poisson 5-10 par la cage
- Retirer morts et garder une trace
- Modifier manuellement l'eau chaque jour
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