Biology

Il trapianto di midollo renale intero in Zebrafish adulti

Published: February 25, 2007 doi: 10.3791/159

Jocelyn LeBlanc¹, Teresa Venezia Bowman¹, Leonard Zon¹

¹Children's Hospital, Harvard Stem Cell Institute, Harvard Medical School

Summary

Abstract

Le cellule staminali ematopoietiche (HSC) sono una rara popolazione di cellule pluripotenti che mantengono tutti i lignaggi di sangue differenziato per tutta la vita di un organismo. La definizione funzionale di un HSC è una cellula trapiantato che ha la capacità di ricostituire tutte le linee di sangue di un destinatario irradiato lungo termine. Questa designazione è stato istituito con decenni di lavoro seminale nei sistemi mammiferi. Utilizzando il trapianto di cellule ematopoietiche (HCT) e invertire manipolazioni genetiche nei topi, i fattori alla base della biologia regolamentazione HSC cominciano a essere svelata, ma sono ancora in gran parte sotto-esplorato. Recentemente, il pesce zebra è emersa come un potente modello genetico per lo studio ematopoiesi vertebrati. Stabilire HCT in zebrafish permetterà agli scienziati di utilizzare su larga scala metodologie di screening genetici e chimici disponibili in zebrafish per rivelare nuovi meccanismi alla base regolamentazione HSC. In questo articolo, si dimostra un metodo per eseguire HCT in zebrafish adulti. Mostriamo la dissezione e la preparazione del pesce zebra midollo renali tutto, il sito di emopoiesi adulti nel pesce zebra, e l'introduzione di queste cellule del donatore nella circolazione dei pesci destinatario irradiati tramite iniezione intracardiaca. Inoltre, si descrive la post-trapianto cura dei pesci in una "terapia intensiva" per aumentare la loro salute a lungo termine. In generale, cura delicata del pesce prima, durante e dopo il trapianto è fondamentale per aumentare il numero di pesci che sopravviverà più di un mese successivo alla procedura, che è essenziale per la valutazione di lungo termine (<3 mesi) l'attecchimento. I dati sperimentali utilizzati per stabilire questo protocollo verrà pubblicato altrove. L'istituzione di questo protocollo permetterà la fusione di grandi dimensioni genetica zebrafish e biologia dei trapianti.

Protocol

Irradiazione

Irradiare pesce WT a 25Gy 2 giorni prima del trapianto

Dissezione del rene

Sacrificio adeguato numero di donatori fluorescente in tricaine (~ 100 ml 4mg/ml Tricaine / litro di acqua di pesce) (media di 500.000 cellule per pesce donatore)
Isolare renali in 0.9x PBS + 5% + 1% FCS Penn strep ("PBS +") in tubo
Rompere con una pipetta 1 ml, poi con la siringa da 10 ml con 18 1 / 2 aghi G
Trasferimento in forma conica 50mL e riempire con PBS +
Spin down @ 1500rpm 8min
Riversa, risospendere pellet in grandi quantità e filtrare su filtro 40micron
Spin down @ 1500rpm 8min
Riversa, risospendere in 1 ml di PBS +, trasferimento in tubo Eppendorf
Per contare: 10ul cellule sol + 90ul trypan blu (ora è 10 volte più diluito)
10ul cellula sol 90ul PBS + + (ora è 10 volte più diluito)
Lasciate riposare 5 minuti, aggiungere 10ul sia sol ai lati della emocitometro
Contare le celle nella casella di grandi dimensioni (5x5), rappresentano percentuale morte se significativi
Cellule / ml = (numero di cellule) (10 ⁴⁾ (x10 dil. Fattore)

Esempio - 60 celle si contano sulle emocitometro 6.000.000 cellule totali
Spin down campione @ 1500rpm 8min
Calcolare il volume per sospendere di nuovo pellet per ottenere la concentrazione appropriata di cellule
5UL volume totale per iniettare - 3UL WKM essere e 2ul sangue periferico è
Esempio - ha 6.000.000 cellule totali

vuole trapianto 200.000 cellule per destinatario

hanno 20 destinatari

vogliono 66.667 cellule / ul (200.000 cellule / 3UL)

risospendere pellet in 90ul (6.000.000 cellule / 66.667 cellule / ul)

solo bisogno di circa 60ul di che (x 20recip 3UL)

L'estrazione del sangue periferico

Sacrificio numero appropriato di pesci WT in tricaine (~ 100 ml 4mg/ml Tricaine / litro di acqua di pesce) portatore di sangue (media di 2.000.000 cellule per donatore)
Anticoagulante: 1UL diluire (3unit/ul) in 1 ml di PBS +
Pipetta punta cappotto con eparina, pugnalata attraverso branchie con punta pipetta, aggiungere sangue al PBS +
Spin 1500rpm 5min, risospendere in 1,5 ml
Spin 1500rpm 5min, risospendere in 1 ml
Filtrare su filtro 40micron
Contare le celle come sopra
Cellule / ml = (numero di cellule) (10 ⁴⁾ (x10 dil. Fattore)
Conto per la morte
Calcolare il volume risospensione come sopra

Iniezione

Iniettare 5UL nel cuore di ogni destinatario utilizzando una siringa Hamilton
Anestetizzare pesce in tricaine (4.2ml (4mg/ml) Tricaine / 100ml di acqua di pesce) e il luogo di spugna umida
Inserire punta un po 'dietro cuore
Curiosare zona del cuore fino a vedere uno scoppio di sangue (il che significa che ha colpito il cuore) -> non vedere questo, ma comunque iniettare

Pesce ICU - post-iniezione