Intranucleares microinjeção de DNA em Dissociated neurônios de mamíferos adultos

Summary

Intranuclear injeção direta de cDNA é uma técnica eficaz para transfecção células pós-mitóticas. Este método oferece altos níveis de expressão da proteína heteróloga a partir de uma ou várias construções de cDNA e permite que a função da proteína a ser estudada em um ambiente fisiologicamente relevantes com uma variedade de ensaios única célula.

Abstract

Principal as culturas de células neuronais são ferramentas valiosas para o estudo da função das proteínas, já que representam um sistema biologicamente mais relevantes em comparação com linhagens de células imortalizadas. No entanto, o carácter pós-mitóticas de neurônios primários impede a expressão da proteína heteróloga efetiva utilização de procedimentos comuns, tais como eletroporação ou quimicamente mediadas transfecção. Assim, outras técnicas devem ser empregadas de forma eficaz para expressar proteínas nestas células não-divisão.

Neste artigo, descrevemos os passos necessários para realizar injeções intranuclear de construções de cDNA em dissociada adulto neurônios simpáticos. Esta técnica, que tem sido aplicado a diferentes tipos de neurônios, pode conseguir induzir a expressão da proteína heteróloga. O equipamento essencial para o procedimento de microinjeção inclui um microscópio invertido para visualizar as células, uma pipeta de injeção de vidro preenchidos com solução de cDNA que é conectado a um sistema de entrega de ₂ N _(g) de pressão, e um micromanipulador. O micromanipulador coordena o movimento injeção de pipeta de microinjeção, com um breve pulso de N ₂ pressurizado para ejetar solução cDNA a partir da ponta da pipeta.

Esta técnica não tem a toxicidade associada a muitos outros métodos de transfecção e permite construções de DNA múltipla para ser expressa em uma relação consistente. O baixo número de células injetadas torna o procedimento microinjeção adequado para estudos de única célula, tais como gravações eletrofisiológicas e de imagem óptico, mas pode não ser ideal para os ensaios bioquímicos que exigem um maior número de células e uma maior eficiência de transfecção. Apesar de microinjeções intranuclear exigir um investimento de equipamentos e de tempo, a capacidade de atingir altos níveis de expressão de proteínas heterólogas em um ambiente fisiologicamente relevantes torna esta técnica uma ferramenta muito útil para investigar a função da proteína.

Protocol

I. Preparação para a injecção

Esta seção descreve as etapas de preparação que precisam ser tomadas antes da injeção de cDNA para o núcleo dos neurônios. O procedimento de isolamento para os neurônios está além do escopo deste artigo, mas é importante ter neurônios dissociados em células individuais e aderir bem à superfície inferior de 35 mm pratos de cultura de células (veja a discussão para dicas úteis para conseguir isso). Embora uma variedade de diferentes neurônios podem potencialmente ser usados, gânglios periféricos, como o gânglio cervical superior (GCS), ou os gânglios da raiz dorsal são os preferidos para dissecção porque são convenientemente acessível e produzir um grande número de neurônios. Vantagens adicionais do uso de neurônios SCG é que eles são uma população relativamente homogênea de células e bem caracterizados ^1,2,3,4.

A. Preparação de plasmídeo cDNA para injecção

1. Para evitar a contaminação ou degradação do DNA, devem ser usadas luvas durante a preparação.
2. DNA que codifica a proteína de interesse é subclonado em um vetor de expressão adequado de mamíferos, como o PCI (Promega, Madison, WI), sob a regulação do altamente e constitutivamente ativa por citomegalovírus promotor (CMV). Se a proteína não é rotulado, um plasmídeo repórter, EGFP codificação por exemplo (pEGFP-N1, BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA), é co-injetados para confirmar a injeção de sucesso e de expressão. DNA é isolado usando uma coluna de separação de alta qualidade (por exemplo, QIAfilter Midi-prep kit, Qiagen, Chatsworth, CA) e mais purificada usando uma unidade centrífuga de filtro com um filtro de PVDF (0,1 mícron, Millipore, Bedford, MA) para remover partículas no preparação plasmídeo, que podem obstruir pipetas de injeção durante o processo de injeção. Plasmídeos são armazenadas a -20 ° C em uma concentração de aproximadamente 1 mg / mL em tampão apropriado DNA de armazenamento (por exemplo, tampão TE: 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0).
3. Imediatamente antes da microinjeção, cDNAs plasmídeo são diluídos e misturados à concentração final desejada em tampão TE ou ₂ H O. Tipicamente, 5-10 ng / mL do gene repórter é suficiente para rotular células injetadas, ea concentração total de cDNA a ser injetado não deve exceder 200 ng / mL desde DNA é viscoso em altas concentrações e pode obstruir pipetas de injeção. Um pequeno volume de cDNA injectável (mL 5-10) é preparado por mistura gotas de solução sobre a superfície limpa de um pequeno pedaço de Parafilm (lado debaixo do suporte em papel). Misture as gotas de solução em conjunto por pipetagem cima e para baixo várias vezes com um pipetor e evitar a introdução de bolhas de ar durante a mistura.
4. Usando a ponta da pipeta microloader (Eppendorf, Brinkmann Instruments, Westbury, NY), transferir a solução para um tubo de cDNA hematócrito especialmente preparado (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA). Consulte a secção de materiais para obter instruções sobre como preparar tubos de hematócrito (Tabela de Materiais). Coloque o tubo de hematócrito contendo solução injectável cDNA em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
5. Centrifugar o tubo por 15-30 min a 10 000 g em microcentrífuga equipado com um rotor balde de ângulo fixo ou oscilante (Eppendorf), em temperatura ambiente (20-24 ° C) a partículas de sedimento na solução de cDNA que possam bloquear a microinjeção pipeta. A solução injectável cDNA pode ser mantido em temperatura ambiente durante a sessão de injeção.

B. Fabricação de injeção de pipetas

1. Pipetas de vidro descartáveis ​​microinjeção estão comercialmente disponíveis (Femtotips por exemplo, Eppendorf), que são convenientes, mas caro (US $ 10 por pipeta de microinjeção). Pipetas de injeção podem ser fabricados em laboratório, utilizando um P-97 programáveis ​​extrator pipeta Flaming Brown (Sutter Instrument Company, Novato, CA) e filamentosas, de paredes finas tubos de vidro de borosilicato capilar (Instrumentos de Precisão Mundial, Sarasota, FL). Esta opção é mais rentável e permite o controle de forma microinjeção pipeta e tamanho.
2. Um programa de dois estágios é usado para puxar pontas de pipeta estreita microinjeção. Desde a abertura do pipetas de microinjeção é demasiado estreita para examinar sob um microscópio de luz, a qualidade de pipetas de injeção tem que ser avaliada diretamente pela injeção de algumas células antes de as configurações do programa são finalizadas. A seguir estão as configurações aproximado para ajustes do calor, puxe, velocidade e tempo: (pull 1) 600, 115, 15, 250; (pull 2) 640, 130, 65, 200. Essas configurações variam de acordo com diferentes lotes de vidro e pela condição do filamento de aquecimento no extrator, e deve ser ajustado conforme a necessidade. Para mais detalhes veja ^5.
3. Puxe várias pipetas (2-5) de injeção por prato de neurônios a ser injetado, em caso de danos ou problemas durante a sessão de injeção. Pipetas de injeção armazenar em um recipiente coberto para evitar a entrada de poeira a ponta da pipeta de microinjeção.

II. Microinjeção intranucleares

tenda "> Esta seção detalha o processo de injeção de cDNA para o núcleo dos neurônios. microinjeção A configuração básica inclui um microscópio de contraste de fase invertido (eg Nikon DTM Diaphot, Nikon, Melville, NY) para visualizar o processo, micromanipulador (eg Eppendorf 5171) para controlar o movimento da pipeta de injeção e uma pressão de injeção (por exemplo, Eppendorf FemtoJet Express) para expulsar a solução cDNA da pipeta. Conectando a pressão injector ao micromanipulador permite a sincronização dos dois últimos processos durante as injeções. Outros opcional, mas altamente recomendado, componentes incluem um sistema de monitoramento montada de vídeo (câmera CCD, Cohu Inc., San Diego, CA, preto e branco para monitores de vídeo, a Sony Corporation, Tóquio, Japão). Este sistema não é um requisito absoluto para injectáveis; No entanto, o monitor preto e branco oferece alto contraste para melhor visualização do núcleo da célula e oferece uma experiência de visualização mais confortável durante longas sessões de injecção. Além disso, um computador portátil que executa o software para operar um controlador de mão pode ser utilizada para semi- automatizar o processo de injecção (ver discussão para detalhes).

O tempo ideal para injetar neurônios SCG é de 3-6 horas pós-dissociação. Nesta fase, as células são esféricas, fortemente ligado ao fundo do prato, eo núcleo é claramente visível, sob um microscópio de contraste de fase, como uma central rodada organela com uma membrana escura, contendo uma nucléolos únicos ou múltiplos (Figura 1A).

1. Coloque um prato de neurônios dissociados no centro do palco microscópio. Ajustar o foco e otimizar a ótica de contraste de fase do microscópio para os núcleos de neurônios são claramente visíveis.
2. Pipete 2 de solução de cDNA preparado em uma pipeta de microinjeção usando uma ponta da pipeta microloader. Evitar a elaboração de solução perto do fundo do tubo de hematócrito pois isso pode atiçar partículas que se instalaram durante a centrifugação. O filamento da microinjeção pipetas devem ajudar na elaboração solução para a ponta, mas se pequenas bolhas de ar persistirem, suavemente dê pequenos toques do lado do vidro para desalojá-los.
3. Inserir a pipeta de microinjeção no suporte da pressão capilar injector e depois segura o titular ao micromanipulador. O titular é fixada em um ângulo de 45 °.
4. Abaixe a pipeta de microinjeção no prato. Como a pipeta entra no meio de cultura, um menisco é formado que afeta a refração da luz e reduz a qualidade da imagem dos neurônios. Para aliviar este problema, a torre do anel de fase pode ser levemente deslocada até os núcleos de neurônios são claramente visíveis novamente.
5. Alguns sistemas de injeção de pressão têm uma função "clean", que aplica uma pressão de ar máxima da ponta da pipeta de microinjeção de curta duração. Use esta função para limpar a pipeta de detritos antes do início e durante as injeções se a ponta aparece entupidos. Se o líquido dissipado não é visível na tela ao mesmo tempo utilizando esta função, substitua com uma pipeta nova injecção.
6. Centro de pipeta a microinjeção no monitor de visualização e alinhe a ponta ao lado de um neurônio e no mesmo plano focal como o nucléolo. Defina esta posição como o limite inferior do eixo z na micromanipulador. Esta posição é a profundidade da pipeta de microinjeção vai avançar para durante as injeções. Agora a posição da ponta de aproximadamente 30 mm acima deste ponto para que a microinjeção pipeta limpa o top dos neurônios.
7. O "injetar" modo de um micromanipulador Eppendorf 5171 pode ser definido com as seguintes configurações para realizar injeções intranuclear. A função é definida em injetar, enquanto a função é empalar parou. Um caminho de injeção diagonal (ao longo do x e eixo z) produz o mínimo de danos às células e, portanto, o modo axial deve ser usado para injeções. Uma velocidade de injeção de 300 mm / s é suficiente, e sincronizar acúmulo de pressão quando a pipeta de microinjeção atinge o conjunto de eixo z limite.
8. A pressão de injeção controla a quantidade de solução cDNA injetada no núcleo. No modo de injeção "automático", a entrega de DNA é controlada por tempo e iniciado pelo micromanipulador conectado. A pressão de injeção (Pi) deve ser definido entre 100 a 200 hectopascais (hPa; 1 hPa ~ 0,015 psi); altas pressões de injeção não melhorar as taxas de sucesso ou qualidade de injeções e podem indicar outros problemas com o tamanho da ponta da pipeta de microinjeção de DNA ou pureza . Uma duração de injeção (TI) de 0,3 s e uma pressão de compensação (Pc), de 30 hPa, que fornece uma pressão positiva constante para evitar a entrada de oclusão partículas do meio de cultura para a ponta da pipeta, deve ser usado.
9. Posição do neurônio para ser injetado sob a ponta da pipeta de microinjeção usando o controle do microscópio estágio xy eixo. Alinhe a ponta da pipeta acima do centro do núcleo, concentrando-se para trás e para frente entre tele a ponta e os nucléolos.
10. Injetar o núcleo, pressionando o botão injetar (no micromanipulador). Para a etapa de injeção, o movimento da pipeta de microinjeção e da libertação de solução de cDNA são controlados pelo micromanipulador. É difícil confirmar sucesso injeções intranuclear por olho, mas a injeção da solução de viscosidade relativamente baixa cDNA (em comparação com o ambiente viscoso nuclear), muitas vezes aparece como uma pluma branca sob a óptica de contraste de fase e pode ser usado como um indicador da injeção para o núcleo. Às vezes, a pipeta de microinjeção não penetrar a membrana nuclear e simplesmente cutuca o núcleo. Uma tentativa segunda injeção na mesma posição pode levar a uma injeção bem-sucedida de DNA no núcleo. Inchaço da célula é normalmente indicativo de injeção citoplasmática não intencional. Além disso, o inchaço nuclear significativo não é bem tolerado pelos neurônios e geralmente resulta em morte celular logo depois, assim, a pressão de injeção e duração não deve exceder os valores sugeridos.
11. Continue injetando neurônios reposicionando o estágio do microscópio para alinhar o neurônio seguinte de acordo com a pipeta de microinjeção. Sistematicamente navegar através do prato para injetar cerca de 5-10 núcleos antes de devolver o prato de neurônios para a incubadora para a incubação durante a noite. Neurônios injetou com sucesso podem ser identificados no dia seguinte pela expressão do gene repórter.

III. Resultados representante

Figura 1: Superior gânglio cervical (SCG) neurônios.
Imagem de contraste de fase da SCG neurônios três horas pós-dissociação (A). Nesta fase, o núcleo é claramente visível que auxilia o alinhamento da ponta da pipeta de microinjeção. O núcleo aparece no centro de neurônios com um único (à esquerda) ou múltiplos nucléolos (direita) escura.
SCG neurônios 16 horas após a injeção de EGFP cDNA para o núcleo (B). Esquerda, SCG neurônios visto sob iluminação de contraste de fase. Direito, a imagem de epifluorescência dos neurônios mesmo mostrando injeção bem sucedido e resultando expressão EGFP em um neurônio.
Branco barra de escala é de 20 mM.

Figura 2: Whole-cell gravações de correntes através heterologously-expressa proteína G acoplada internamente retificar K ⁺ (GIRK) canais de SCG neurônios.
GIRK correntes (I _GIRK) foram evocados por uma rampa de tensão 200 ms de -140 a +40 mV a partir de um potencial de realização de -60 mV (inset de A) ativação seguintes endógenos α _{2-adrenérgicos} por norepinefrina (NE, 10 mM) . Traços sobrepostos são gravações a partir do mesmo neurônio e indicar, antes (preto) e após a aplicação de qualquer NE sozinho (azul) ou NE, acrescido de 10 mM Ba ^{2 +} (vermelho). Linhas tracejadas indicam o nível zero de corrente.
Para gravar eu _GIRK, a solução externa contida (em mM) 130 NaCl, 5,4 KCl, 10 HEPES, 10 CaCl _2, 0,8 MgCl _2, 15 de glicose, 15, sacarose e 0,0003 TTX, pH ajustado para 7,4 com NaOH. A solução de gravação interna contida (em mM) 135 KCl, 11 EGTA, um CaCl _2, MgCl 2 _2, 10 HEPES, 4 MgATP, e 0,3 Na ₂ GTP, ajustada para pH 7,2 com KOH.
A falta de corrente provocada pela rampa de tensão na presença do NE em neurônios uninjected SCG (A) demonstra que os neurônios SCG não expressam canais GIRK endógena. Injeção de sucesso de codificação cDNA plasmídeo funcional GIRK canal ¹¹ dá origem a grandes correntes durante a rampa de tensão quando expostos à NE (B, esquerda). Correntes têm as características típicas das correntes através de canais GIRK: ativação por um agonista do receptor acoplado à proteína G (NE), retificação para dentro, e bloco de correntes pelo bloqueador putativa GIRK canal, Ba ^{2 +} (B, traço vermelho à direita). Círculos abertos e cheios representam Eu _GIRK na exploração e corrente de pico, respectivamente. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada da figura 2.

Discussion

Problemas comuns encontrados e sugestões:

Como mencionado anteriormente, sucesso injeções nuclear dependem de células aderentes com placas de cultura de tecidos. Adiando o início das injeções de algumas horas após o procedimento de dissociação celular permite que os neurônios para aderir ao fundo de pratos. Além disso, pratos revestimento com 0,1 mg / ml de alto peso molecular de poli-L-lisina (Sigma, St. Louis, MO) auxiliares de adesão de neurônios para a superfície inferior de pratos.

Bloqueio de pipetas de microinjeção, especialmente quando se tenta injetar uma alta concentração de DNA, pode ser um problema freqüente. Utilizando colunas de separação de alta qualidade para isolar e purificar DNA plasmídeo, e executar as etapas de purificação adicional mencionado (filtros de spin, girando em tubos de hematócrito) pode ajudar a remover partículas antes da injeção. Durante as injeções, a função "clean" da pressão de injeção pode ser usado (por 0,2 s é suficiente), mas se isso não resolver o problema, uma pipeta nova injecção deve ser usado. Se a maioria das pipetas de microinjeção ficar obstruídos durante uma sessão de injeção, considere alterar as configurações do extrator pipeta de vidro para produzir pontas de pipeta de microinjeção, com uma maior abertura.

Outra questão que surge durante as injeções nuclear é a irregularidade da superfície do fundo de pratos de cultura de tecidos. Essa variabilidade afeta diretamente a precisão da focalização de pontas de pipeta de injeção para o núcleo desde a profundidade da pipeta atravessa durante as injeções é fixo. Portanto, este limite eixo z deve ser ajustada durante o curso de injeções dentro do mesmo prato. Torna-se evidente quando um ajuste é necessário: não haverá indicação de injeção nuclear (sem pluma branca no núcleo ou célula está totalmente perdida), ou a ponta da pipeta de injeção vem perto do fundo do prato (comprimindo a célula ou mesmo bater a ponta da pipeta no fundo do prato). Vidro clonagem cilindros (. OD 10 mm, Cat. 2090-01010, Bellco Glass, Vineland, NJ) pode ser usado durante o revestimento dos neurônios limitá-los em uma área menor, mais confinados; minimizando assim a distância necessária para mover a pipeta de injeção entre as injecções. Estes cilindros clonagem são removidos antes de executar microinjeções.

Desvantagens da técnica:

Microinjeções intranucleares são tecnicamente exigente, que requer paciência e um alto grau de destreza manual pelo operador. Proficiência com esta técnica, como com qualquer outra habilidade, vem com a prática. Assim, é aconselhável a prática de injeções nuclear do gene repórter sozinho antes de tentar experimentos reais. Para ajudar ainda mais o processo de injeção, pode ser possível consolidar os passos do micromanipulador e pressão injector em um programa de computador. Programas como o Pro Igor (WaveMetrics, Lake Oswego, OR) pode ser utilizado para armazenar as configurações microinjeção e programar controladores multifuncional (ShuttlePRO, Contour Design, Windham, NH) para semi-automatizar o processo de injecção (ver 6,7,8 para detalhes).
Outra desvantagem da técnica de microinjeção intranuclear é a baixa taxa de sucesso. Aproximadamente 10-20% das tentativas de injeções nuclear levar a expressão da proteína. Embora essa eficiência pode ser suficiente para aplicações que não requerem um grande número de células que expressam, eletrofisiologia, por exemplo, por vários ensaios bioquímicos isso pode não ser suficiente.

Aplicações da técnica:

Apesar de suas desvantagens, intranuclear microinjeção de DNA é uma técnica extremamente útil para heterologously expressando proteínas em neurônios.

Altos níveis de expressão da proteína são alcançados com microinjeções nuclear por causa do grande número de plasmídeos lançado para dentro do núcleo durante as injeções, uma altamente ativo promotor CMV regulação da transcrição de genes, e estabilidade a longo de plasmídeos no núcleo. Proteína sobre-expressão é especialmente útil em dominante negativo experimentos onde os altos níveis de proteínas heterólogas são obrigados a sobrecarregar a proteína endógena. Outra vantagem do intranuclear injeções é a capacidade de realizar uma parte consistente de construções de cDNA para o núcleo quando constrói múltiplas são injetados. Com os métodos de transfecção outro, é difícil reproducibly introduzir a mesma proporção de cada DNA em células de construir diferentes dentro do mesmo prato e entre transfections. Injeção direta de solução de cDNA para o núcleo elimina essa fonte de variabilidade e permite que a proporção de proteínas expressas a ser tituladas de forma eficaz.

Métodos de transfecção tradicionais têm eficácia limitada em células pós-mitóticas por causa da baixa incorporação de DNA no núcleo ⁹ e toxicidade química associada Reag transfecçãoents ^10. Microinjeções nuclear superar esses problemas através da introdução de material genético mecanicamente para o núcleo. Embora esta técnica é mais envolvidos, a capacidade de estudar o efeito de uma proteína em um sistema funcional biológico, com vias de sinalização endógena, mais do que compensa a natureza laboriosa desta técnica.

Todos os procedimentos experimentais em animais foram realizados de acordo com os Institutos Nacionais de Saúde Diretrizes para a Animal Care e Utilização.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ultrafree-MC Filter Unit	EMD Millipore	UFC30VV00	Durapore PVDF filter; 0.1 μm pore-size
TE buffer	Quality Biological, Inc.	351-010-131	10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.0
Micro-hematocrit capillary tubes	Fisher Scientific	22-362-574	Unheparinized Preparation: Soak in 100% ethanol overnight. Wash thoroughly with deionized water three times and dry bake glass in an oven (95°C). Cut the cleaned hematocrit tubes into 3-4 cm length pieces using a diamond-tipped scriber, and seal one end closed with a flame and forceps to hold the glass. Store in a clean glass beaker and cover to prevent dust build-up.
Microcentrifuge	Eppendorf	5417 R	With a fixed angle or swinging-bucket rotor
Microloader 20 μl pipet tips	Eppendorf	5242 956.003
Microinjection capillary glass	World Precision Instruments, Inc.	TW120F-4	Thin-walled with filament, 1.2 mm outer-diameter, 0.9 mm inner-diameter, 100 mm length
Flaming/Brown Micropipette Puller	Sutter Instrument Co.	P-97	With platinum-iridium box filament (part # FB330B)
Nikon Diaphot TMD Inverted Microscope	Nikon Instruments		20x and 40x phase-contrast objective lenses, mounted on a vibration isolation table
Charge-coupled device (CCD) camera	Cohu Inc.	6410
Video monitor	Sony Corporation	PVM-122	Black and White, 9” screen
Micromanipulator system	Eppendorf	5171
Microinjection Unit	Eppendorf	FemtoJet Express
Microinjection controller	Contour Design	S-PROV2	Programmable multimedia controller
Igor Pro	WaveMetrics	Version 4.05A	Command program to control the microinjection controller written by S. Ikeda