Summary
A cascata de adesão de plaquetas ocorre na presença de fluxo de cisalhamento, não um fator contabilizado em convencional (estática) bem-placa ensaios. Este artigo relata um ensaio de agregação plaquetária, utilizando um formato de prato bem-microfluídicos para emular condições fisiológicas do fluxo de cisalhamento.
Abstract
Agregação plaquetária ocorre em resposta à lesão vascular, onde a matriz extracelular abaixo do endotélio tem sido exposto. A cascata de adesão de plaquetas ocorre na presença de fluxo de cisalhamento, não um fator contabilizado em convencional (estática) bem-placa ensaios. Este artigo relata um ensaio de agregação plaquetária, utilizando um formato de prato bem-microfluídicos para emular condições fisiológicas do fluxo de cisalhamento. Proteínas extracelular, colágeno I ou fator de von Willebrand são depositados dentro do canal microfluídicos com uso de perfusão ativa, com uma bomba pneumática. As proteínas da matriz são, então, lavados com buffer e bloqueados para preparar o canal microfluídicos para interações de plaquetas. Sangue total marcada com corante fluorescente é perfundido através do canal em várias taxas de fluxo, a fim de conseguir a ativação e agregação plaquetária. Inibidores da agregação plaquetária pode ser adicionada antes do experimento célula de fluxo para gerar IC50 dados de resposta de dose.
Protocol
Parte 1: Preparação dos canais microfluídicos de uma placa BioFlux.
- Antes de executar o experimento célula de fluxo, é preciso preparar os canais microfluídicos com uma camada de proteína de interesse. Neste caso, o colágeno I será utilizado. Cada canal tem uma entrada e uma saída bem. Para esta placa, a entrada também é a esquerda bem alimentar o canal ea saída está bem à direita.
- Diluir o colágeno I revestimento (5mg/ml de ações) para a concentração 200μg/ml em ácido acético 0,02. Será necessário 20μl para cada canal utilizado. Misture por triteration gentil com uma ponta de micropipeta.
- Adicionar 20 l de revestimento para cada canal respectivo para ser utilizado. Deve-se dispensar o líquido para dar um soco interior da tomada assim alimentar o canal de microfluídica de interesse usando uma micropipeta. Evitar a introdução de bolhas, não empurre o ar para fora da pipeta. Incluir um canal sem colágeno para um controle de colágeno não (controle negativo para a adesão e agregação).
- Anexar a interface para a placa de primeiro dedo de apertar os 4 parafusos e, em seguida, uma vez que está tudo pronto, use o driver de torque para apertar completamente. O motorista torque vai clicar quando atinge a tensão máxima.
- Usando o modo manual no software BioFlux, aplicar perfusão para os canais de interesse em 2dyn/cm 2-o da tomada também. Aqui é preciso prestar atenção para o soco oposto interior para ser preenchido com líquido. Isso levará alguns minutos. Um pode assistir a este ocorrer a partir da objetiva de baixa potência em um microscópio (4X) e encontrar a entrada de bem ou segurando o prato e olhando para os poços de entrada de baixo. Deve-se primeiro ver uma conta minúscula de líquido que enche lentamente o soco interior. Uma vez que o soco de entrada interior está cheio, pare de perfusão de uma só vez, empurrando parar no software.
- Incubar a placa em temperatura ambiente por uma hora.
- Remover a interface e adicionar 1 ml de PBS (mais Ca 2 + / Mg 2 +) para a saída bem. Iniciar a perfusão da tomada bem na 2dyn/cm 2. Continue perfusão por 10 minutos. Pare de perfusão e remover a interface.
- Retire o excesso de PBS tanto de entrada e saída de poços - nunca remover o líquido que preenche o soco interior. Bloquear os canais utilizando solução de bloqueio (0,5% v / v BSA em PBS (mais Ca 2 + / Mg 2 +)). Adicionar 1 ml de solução de bloqueio para cada saída também para ser usado e perfundir da tomada bem na 2dyn/cm 2. Continue perfusão por 10 minutos. Pare de perfusão e remover a interface. Canais preparados até esta etapa pode ser usado durante todo o dia.
- Antes de adicionar o sangue, remover o líquido em ambos os lados do canal, exceto para os socos interior.
Parte 2. Preparando o sangue com GPIIb / IIIa de anticorpos inibidores.
- Enquanto que o colágeno é incubar nos canais, é preciso preparar o sangue total. Deve-se seguir as normas de biossegurança ditada por seu / sua instituto ao manipular sangue humano.
- Sangue humano fresco (de um indivíduo em jejum), feita em anticoagulante citrato de sódio deve ser usado dentro de 3 horas após a coleta.
- Prepare sangue adicionando calceína 4μM AM. Prepare um estoque 4mM de calceína AM em DMSO e adicionar sangue numa diluição de 1 / 1000 v / v. Misture por inversão suave.
- Dispensar 1 ml da calceína AM rotulados de sangue em 10 - 1,5 ml microtubos. Adicionar GPIIb / IIIa anticorpo inibidor para cada na diluição desejada (o peso molecular de IgG é de ~ 150kDa). Uma série de diluição exemplo é de 1200nm para 9nM e inclui um controle de anticorpos não e um controle de anticorpos não relacionados. Um excelente controle positivo para a inibição seria ReoPro (abciximab, Eli Lilly) em uma concentração de 20ug/ml. Misture por inversão suave.
- Incubar a temperatura ambiente por 1 hora. Misture por inversão suave a cada 10 minutos.
Parte 3: A execução do experimento de célula de fluxo na estação de trabalho BF1000.
- Primeiro, é preciso estabelecer um protocolo automatizado no módulo de controle BioFlux. Para colágeno I, deve-se estabelecer um protocolo para executar 10dyn/cm 2 para 10 minutos da tomada também. Neste ponto, deve-se também configurar os parâmetros de aquisição de dados usando a estação de trabalho BF1000, incluindo posições de canal, captura em comprimento de onda FITC e lapso de tempo da informação. Recomenda-se a captura de três campos de vista usando uma objetiva de 10x por canal a cada 30 segundos sobre uma duração de 10 minutos no total.
- Trabalhar rapidamente lugar, 500ul de sangue preparada de cada condição em separado canais preparados. Lugar nenhum sangue controle de anticorpos em um canal que é revestido com colágeno e um que é apenas bloqueado.
- Lugar da interface na placa.
- Coloque a placa no microscópio workstation BF1000. Grampo na interface.
- Executar o ajuste de carga de placa. Além disso, mover palco para um sangue bem que o contém. Set FTImagem IC parâmetros de captura (tempo de exposição, etc ... ganham).
- No software de montagem BioFlux, iniciar a aquisição de começar o fluxo e aquisição simultaneamente.
- Retirar a placa da estação de trabalho BF1000, dispor de placa de acordo com as diretrizes institucionais.
Parte 4: Resultados Representante.
Aqui, o protocolo de adesão e agregação plaquetária em canais microfluídicos foi apresentado. Tratamento com um inibidor da agregação plaquetária, anti-GPIIb/IIIa também foi incluído no protocolo. Usando colágeno revestido canais microfluídicos do sistema BioFlux, deve-se esperar para ver a formação de trombos agressivo ao longo do tempo com a amostra não tratada de controle de sangue e não a formação de trombos no canal sem revestimento. Em um experimento realizado recentemente, o tamanho médio de agregados em condições de controle foi 2000μm 2.
Figura 1. 
Ativado GPIIb / IIIa é potente mediador de plaquetas plaquetas interações e estabilização de agregação 1. Adesão ao colágeno ativa o complexo GPIIb / IIIa para obter esta resposta 2. Após a incubação com anti-GPIIb/IIIa por 1 hora antes da exposição ao cisalhamento, deve-se esperar para observar uma diminuição no tamanho dos trombos, assim como uma diminuição na freqüência de formação de trombos. Uma resposta dose-dependente geralmente pode ser observado em 10dyn/cm 2.
Figura 2. 
O IC 50 valor para este inibidor específico foi 17nM a 10 dyn / cm 2. Inibição máxima (para o doador) em relação ao controle de nenhum anticorpo foi de 11% a 10 dyn / cm 2.
Embora os métodos aqui foram apresentados usando uma proteína da matriz extracelular específica e um inibidor específico da agregação plaquetária, o protocolo é extensível a outros revestimentos, outros tipos de células e outros inibidores para ensaios de adesão celular. Os ingredientes chave para o sucesso de tais experiências são evitar bolhas nos canais microfluídicos, diluição correta de todos os reagentes na diluentes correta, e condições de incubação adequados para todos os reagentes.
Discussion
Embora os métodos aqui foram apresentados usando uma proteína da matriz extracelular específica e um inibidor específico da agregação plaquetária, o protocolo é extensível a outros revestimentos, outros tipos de células e outros inibidores para ensaios de adesão celular. Os ingredientes chave para o sucesso de tais experiências são evitar bolhas nos canais microfluídicos, diluição correta de todos os reagentes na diluentes correta, e condições de incubação adequados para todos os reagentes.
Disclosures
Os autores que contribuem são funcionários da Fluxion Biosciences.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| collagen I, Bovine | Reagent | Invitrogen | A1064401 | other sources of collagen I can be used |
| PBS plus Ca/Mg | Reagent | Invitrogen | 14040-117 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Reagent | EMD Millipore | EM-2930 Bottom of Form | From VWR |
| calcein AM | Reagent | Invitrogen | C1430 | Calcein AM from BD can also be used |
| BioFlux 1000 System | Reagent | Fluxion Biosciences | Contact Company | |
| BioFlux Plate | Reagent | Fluxion Biosciences | 900013 | |
| antiGPIIb/IIIa | Reagent | Abcam | ab33407 | an alternative # is ab15021 |
| ReoPro | Reagent | Eli Lilly | by Rx only |
References
- Jackson, S. P. The growing complexity of platelet aggregation. Blood. 109, 5087-5095 (2007).
- Nakamura, T., Kambayashi, J., Okuma, M., Tandon, N. N. Activation of the GP IIb-IIIa complex induced by platelet adhesion to collagen is mediated by both alpha2beta1 integrin and GP. VI. J Biol Chem. 274, 11897-11903 (1999).
