प्लेटलेट आसंजन और फ्लो तहत एकत्रीकरण Microfluidic फ्लो कक्ष का उपयोग

Summary

प्लेटलेट आसंजन झरना कतरनी प्रवाह की उपस्थिति में जगह लेता है, पारंपरिक (स्थिर) अच्छी तरह से थाली assays के लिए एक कारक नहीं हिसाब. एक प्लेटलेट एकत्रीकरण अच्छी तरह से थाली एक microfluidic प्रारूप का उपयोग करने के लिए शारीरिक कतरनी प्रवाह स्थितियों का अनुकरण परख पर इस लेख की रिपोर्ट.

Abstract

संवहनी चोट जहां endothelium नीचे बाह्य मैट्रिक्स उजागर किया गया है के जवाब में प्लेटलेट एकत्रीकरण होता है. प्लेटलेट आसंजन झरना कतरनी प्रवाह की उपस्थिति में जगह लेता है, पारंपरिक (स्थिर) अच्छी तरह से थाली assays के लिए एक कारक नहीं हिसाब. एक प्लेटलेट एकत्रीकरण अच्छी तरह से थाली एक microfluidic प्रारूप का उपयोग करने के लिए शारीरिक कतरनी प्रवाह स्थितियों का अनुकरण परख पर इस लेख की रिपोर्ट. कोशिकी प्रोटीन, कोलेजन मैं या वॉन Willebrand कारक microfluidic एक साँस पंप के साथ सक्रिय छिड़काव के प्रयोग से चैनल के भीतर जमा कर रहे हैं. मैट्रिक्स प्रोटीन फिर बफर के साथ धो रहे हैं और प्लेटलेट बातचीत के लिए microfluidic चैनल तैयार करने के लिए अवरुद्ध. पूरे फ्लोरोसेंट रंजक के साथ लेबल रक्त विभिन्न प्रवाह दरों पर चैनल के माध्यम से perfused क्रम में प्लेटलेट सक्रियण और एकत्रीकरण हासिल है. प्लेटलेट एकत्रीकरण inhibitors प्रवाह सेल प्रयोग IC50 खुराक प्रतिक्रिया डेटा उत्पन्न करने के लिए पहले जोड़ा जा सकता है.

Protocol

भाग 1: एक BioFlux थाली के microfluidic चैनलों की तैयारी.

1. प्रवाह सेल प्रयोग चल रहा है से पहले, एक microfluidic चैनलों के लिए ब्याज की एक प्रोटीन कोटिंग के साथ तैयार की जरूरत है. इस मामले में, कोलेजन मैं इस्तेमाल किया जाएगा. प्रत्येक चैनल एक Inlet और एक दुकान में अच्छी तरह से किया है. इस प्लेट के लिए, Inlet अच्छी तरह से अच्छी तरह से चैनल और आउटलेट ही सही पर है खिला छोड़ दिया है.
2. 0.02M एसिटिक एसिड में 200μg/ml एकाग्रता कोलेजन मैं कोटिंग (5mg/ml शेयर) पतला. एक प्रत्येक चैनल के लिए इस्तेमाल किया 20μl की आवश्यकता होगी. एक micropipette टिप के साथ कोमल triteration द्वारा मिक्स.
3. प्रत्येक संबंधित चैनल के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए कोटिंग के 20 μl जोड़ें. एक अच्छी तरह से एक micropipette का उपयोग ब्याज की microfluidic चैनल खिला आउटलेट के भीतर पंच में तरल बांटना चाहिए. बुलबुले शुरू करने से बचें, पिपेट की हवा नहीं धक्का बाहर. एक नहीं कोलेजन नियंत्रण के लिए एक कोलेजन के बिना चैनल (आसंजन और एकत्रीकरण के लिए एक नकारात्मक नियंत्रण) शामिल है.
4. थाली करने के लिए पहली उंगली 4 शिकंजा और फिर एक बार वे सब सेट कर रहे हैं, टोक़ चालक का उपयोग करने के लिए पूरी तरह से कस कस द्वारा इंटरफ़ेस संलग्न. टोक़ चालक क्लिक करें जब यह अधिकतम जकड़न तक पहुँच जाएगा.
5. BioFlux सॉफ्टवेयर में मैनुअल मोड का उपयोग ^{करना,} 2 आउटलेट से अच्छी तरह से 2dyn/cm पर ब्याज की चैनलों के लिए छिड़काव लागू. यहाँ एक विपरीत भीतर तरल से भरा जा पंच के लिए देखना चाहिए. यह कई मिनट लग जाएगा. एक घड़ी या तो यह एक खुर्दबीन पर एक कम शक्ति का उपयोग उद्देश्य (4X) और अच्छी तरह से या थाली पकड़े हुए और नीचे से इनलेट कुओं में देख द्वारा प्रवेश पाने हो सकते हैं. एक पहले तरल के एक छोटे से मनका है कि धीरे धीरे आंतरिक पंच भरता है देखना चाहिए. एक बार प्रवेश भीतर पंच भरा है, एक बार में सॉफ्टवेयर में रोक धक्का द्वारा छिड़काव बंद करो.
6. एक घंटे के लिए कमरे के तापमान पर थाली सेते हैं.
7. इंटरफ़ेस निकालें और अच्छी तरह से दुकान को पीबीएस (प्लस ² Ca ⁺ मिलीग्राम / ^{+ 2)} के 1 मिलीलीटर जोड़ने. ² 2dyn/cm में अच्छी तरह से दुकान से छिड़काव शुरू करो. 10 मिनट के लिए छिड़काव जारी रखें. छिड़काव करना बंद करो और इंटरफ़ेस हटायें.
8. दोनों Inlet और आउटलेट कुओं से अतिरिक्त पीबीएस निकालें तरल है कि आंतरिक पंच भरता निकालने कभी नहीं. अवरुद्ध समाधान (0.5% v / v पीबीएस में BSA (प्लस ² Ca ⁺ मिलीग्राम / ^{2 +))} का उपयोग चैनल ब्लॉक . अच्छी तरह से प्रत्येक आउटलेट के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए अवरुद्ध समाधान के 1 मिलीलीटर ^{जोड़ें} और 2 2dyn/cm में अच्छी तरह से दुकान से perfuse. 10 मिनट के लिए छिड़काव जारी रखें. छिड़काव करना बंद करो और इंटरफ़ेस हटायें. इस कदम के लिए तैयार चैनल दिन भर में इस्तेमाल किया जा सकता है.
9. पहले रक्त जोड़ने, चैनल के भीतर घूंसे के लिए दोनों पक्षों पर छोड़कर तरल हटायें.

भाग 2. GPIIb / IIIa निरोधात्मक एंटीबॉडी के साथ खून की तैयारी.

1. जबकि कोलेजन चैनलों में incubating है, एक पूरे रक्त तैयार करना होगा. एक जैव सुरक्षा नियमों का पालन उसकी / उसके संस्थान द्वारा तय जब मानव रक्त से निपटने चाहिए.
2. संग्रह के 3 घंटे के भीतर ताजा मानव (उपवास व्यक्ति से) रक्त में सोडियम साइट्रेट anticoagulant में तैयार किया जाना चाहिए.
3. 4μM calcein AM जोड़ने के द्वारा रक्त की तैयारी. DMSO में AM calcein 4mm शेयर तैयार है और 1 / 1000 v / के कमजोर पड़ने पर रक्त को जोड़ने वी. कोमल उलटा द्वारा मिक्स.
4. 1.5mL microtubes - calcein के 1 मिलीलीटर AM 10 में रक्त लेबल बग़ैर. वांछित कमजोर पड़ने (आईजीजी की आणविक भार 150kDa ~ है) पर प्रत्येक GPIIb / IIIa अवरोध करनेवाला एंटीबॉडी जोड़ें. एक उदाहरण के कमजोर पड़ने श्रृंखला 1200nM से 9nM करने के लिए है और एक नहीं एंटीबॉडी नियंत्रण और एक असंबंधित एंटीबॉडी नियंत्रण शामिल निषेध के लिए एक उत्कृष्ट सकारात्मक नियंत्रण ReoPro 20ug/ml के एक एकाग्रता में (abciximab, एली लिली) होगा. कोमल उलटा द्वारा मिक्स.
5. 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं. कोमल उलटा द्वारा हर 10 मिनट मिक्स.

भाग 3: BF1000 वर्कस्टेशन पर प्रवाह सेल प्रयोग चल रहा है.

1. सबसे पहले, एक BioFlux नियंत्रण मॉड्यूल में एक स्वचालित प्रोटोकॉल सेट करना होगा. कोलेजन के लिए मैं, एक अच्छी तरह से दुकान से 10 ^मिनट के लिए 2 10dyn/cm चलाने के लिए एक प्रोटोकॉल की स्थापना करनी चाहिए. इस बिंदु पर, एक भी डाटा अधिग्रहण BF1000 वर्कस्टेशन का उपयोग पैरामीटर सेट करना चाहिए, चैनल स्थिति सहित, FITC तरंगदैर्ध्य और समय चूक की जानकारी में कब्जा. यह देखने के 3 क्षेत्रों के कुल 10 मिनट की अवधि में प्रति चैनल एक 10x उद्देश्य हर 30 सेकंड का उपयोग करने पर कब्जा करने की सिफारिश की है.
2. जल्दी से काम करते हुए, अलग तैयार चैनलों में प्रत्येक शर्त के लिए तैयार खून की 500ul जगह. एक चैनल है कि कोलेजन और अवरुद्ध है कि बस के साथ लेपित है में कोई एंटीबॉडी नियंत्रण रक्त रखें.
3. थाली पर प्लेस इंटरफ़ेस.
4. BF1000 वर्कस्टेशन खुर्दबीन पर थाली प्लेस. इंटरफ़ेस पर क्लैंप.
5. थाली लोड समायोजन प्रदर्शन. इसके अलावा, एक अच्छी तरह से युक्त रक्त चरण चलते हैं. सेट एफटीआईसी छवि पर कब्जा पैरामीटर (जोखिम समय, लाभ आदि ...).
6. BioFlux असेंबल सॉफ्टवेयर में अधिग्रहण शुरू करने के लिए प्रवाह और अधिग्रहण के साथ शुरू.
7. BF1000 वर्कस्टेशन से थाली निकालें, संस्थागत दिशा निर्देशों के अनुसार प्लेट के निपटान.

भाग 4: प्रतिनिधि परिणाम.

यहाँ प्लेटलेट एकत्रीकरण और microfluidic चैनलों में आसंजन के लिए प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया गया था. एक प्लेटलेट एकत्रीकरण अवरोध करनेवाला के साथ उपचार, anti-GPIIb/IIIa भी प्रोटोकॉल में शामिल किया गया था. कोलेजन BioFlux प्रणाली की लेपित microfluidic चैनलों का उपयोग, एक समय पर इलाज नियंत्रण रक्त के नमूने और uncoated चैनल पर कोई thrombus गठन के साथ आक्रामक thrombus गठन को देखने की उम्मीद करनी चाहिए. एक हाल ही में प्रदर्शन प्रयोग में, नियंत्रण की शर्तों के तहत समुच्चय के ^औसत आकार 2 2000μm था.
चित्रा 1.

सक्रिय / GPIIb IIIa प्लेटलेट प्लेटलेट बातचीत और एकत्रीकरण स्थिरीकरण ^एक शक्तिशाली मध्यस्थ है. कोलेजन के लिए आसंजन GPIIb / IIIa जटिल सक्रिय करने के लिए इस ² प्रतिक्रिया प्रकाश में लाना. Anti-GPIIb/IIIa साथ 1 कतरनी जोखिम से पहले घंटे के लिए ऊष्मायन के बाद, एक thrombi के आकार में कमी के रूप में के रूप में अच्छी तरह से thrombus गठन की आवृत्ति में कमी का पालन करने की उम्मीद करनी चाहिए. एक खुराक पर निर्भर प्रतिक्रिया आम ^तौर पर 2 10dyn/cm पर मनाया जा सकता है.
चित्रा 2.

इस विशेष अवरोध करनेवाला के लिए _आईसी 50 मूल्य 10 dyn के ^{/ 2} सेमी 17nM था . कोई एंटीबॉडी नियंत्रण की तुलना में अधिकतम निषेध (इस दाता के लिए) 10 dyn के ^{/ 2} सेमी पर 11% था .

जबकि यहाँ तरीकों एक विशिष्ट बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन और प्लेटलेट एकत्रीकरण की एक विशिष्ट अवरोध करनेवाला का उपयोग कर प्रस्तुत किए गए, प्रोटोकॉल अन्य कोटिंग्स, अन्य प्रकार की कोशिकाओं और कोशिका आसंजन assays के लिए अन्य inhibitors के लिए एक्स्टेंसिबल है. ऐसे प्रयोगों की सफलता के लिए महत्वपूर्ण अवयवों microfluidic चैनलों, सही सही diluents में सभी अभिकर्मकों के कमजोर पड़ने, सभी अभिकर्मकों के लिए और उचित ऊष्मायन शर्तों में बुलबुले के परिहार हैं.

Discussion

जबकि यहाँ तरीकों एक विशिष्ट बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन और प्लेटलेट एकत्रीकरण की एक विशिष्ट अवरोध करनेवाला का उपयोग कर प्रस्तुत किए गए, प्रोटोकॉल अन्य कोटिंग्स, अन्य प्रकार की कोशिकाओं और कोशिका आसंजन assays के लिए अन्य inhibitors के लिए एक्स्टेंसिबल है. ऐसे प्रयोगों की सफलता के लिए महत्वपूर्ण अवयवों microfluidic चैनलों, सही सही diluents में सभी अभिकर्मकों के कमजोर पड़ने, सभी अभिकर्मकों के लिए और उचित ऊष्मायन शर्तों में बुलबुले के परिहार हैं.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
collagen I, Bovine	Reagent	Invitrogen	A1064401	other sources of collagen I can be used
PBS plus Ca/Mg	Reagent	Invitrogen	14040-117
Bovine serum albumin (BSA)	Reagent	EMD Millipore	EM-2930 Bottom of Form	From VWR
calcein AM	Reagent	Invitrogen	C1430	Calcein AM from BD can also be used
BioFlux 1000 System	Reagent	Fluxion Biosciences	Contact Company
BioFlux Plate	Reagent	Fluxion Biosciences	900013
antiGPIIb/IIIa	Reagent	Abcam	ab33407	an alternative # is ab15021
ReoPro	Reagent	Eli Lilly		by Rx only