Summary
हम यहाँ दिखाने के लिए कैसे करने के लिए वयस्क zebrafish में रेट्रो - कक्षीय इंजेक्शन.
Abstract
पूरी पशुओं के औषध उपचार औषधीय और रासायनिक आनुवंशिक अध्ययन के लिए किसी भी मॉडल प्रणाली में एक अनिवार्य उपकरण है. अंतःशिरा इंजेक्शन (चतुर्थ) अक्सर ब्याज की एक एजेंट के वितरण का सबसे प्रभावी और noninvasive फार्म है. (Zebrafish में
Protocol
भाग 1. इंजेक्शन सामग्री की तैयारी
- टीजी कोशिकाओं (ग्लोबिन: GFP):
- वयस्क दाता 10ul विंदुक हेपरिन (1unit/ul) में गिल के पीछे पंचर मछली लेपित टिप का उपयोग कर मछली भरो.
- Aspirate लाल रक्त कोशिकाओं और सेल बफर में बांटना (0.9X पीबीएस + 5% FBS + 1% पेन / Strep).
- 40uM जाल पर फ़िल्टर सेल निलंबन और hemocytometer के रूप में पहले LeBlanc एट अल द्वारा वर्णित का उपयोग कोशिकाओं की एकाग्रता का निर्धारण.
- नीचे स्पिन और सेल बफर में वांछित ऐसी है कि अंतिम इंजेक्शन की मात्रा 5ul से अधिक नहीं है एकाग्रता में resuspend. यहाँ हम 1.5-2 मिलियन कोशिकाओं / प्राप्तकर्ता इंजेक्षन.
- Dextran, टेक्सास रेड ® के लिए, 10-12 मिलीग्राम / एमएल के एक अंतिम इंजेक्शन एकाग्रता के लिए DPBS में डाई भंग. मछली प्रति 4 उल इंजेक्षन करने के लिए योजना.
भाग 2. इंजेक्शन
- Tricaine में मछली anesthetize (4.2ml (4mg/ml) tricaine/100ml मछली पानी).
- धो हैमिल्टन सिरिंज 70% इथेनॉल इंजेक्शन का उपयोग करने के लिए पहले 3-4 बार. 0.9X DPBS के साथ 3-4 बार कुल्ला करें.
- पृष्ठीय पक्ष मछली और नम स्पंज पर सही का सामना करना पड़ प्लेस
- अपने दाहिने हाथ के साथ और हैमिल्टन सिरिंज सवार पर अपने सूचकांक उंगली के साथ पकड़ो. धीरे अपने बाएँ हाथ के साथ मछली के शरीर को स्थिर.
- जैसे कि अगर मछली आँख की एक घड़ी, सुई 7:00 स्थान पर और मछली (1 आंकड़ा) एक 45 डिग्री के कोण पर इशारा होगा सामना करना पड़ रहा बेवल के साथ सुई स्थिति.
- धीरे 7:00 स्थिति में सुई 1-2 मिमी सम्मिलित है और धीरे धीरे सवार दबाना.
- ताजा E3 पानी में ठीक करने के लिए मछली की अनुमति दें.
- सुई धो, अलग अभिकर्मकों के इंजेक्शन के बीच इसके बाद के संस्करण के रूप में वर्णित,.
- झाड़ सेल समाधान करने के लिए कोशिकाओं सेल clumping को रोकने के लिए हर कुछ मिनट resuspend.
- 1 सप्ताह के लिए दैनिक पानी परिवर्तन के साथ प्रवाह बंद मछली को संक्रमण से बचने के लिए रखें. हम इस अवधि के लिए आईसीयू पानी में मछली रखने (10ml तनाव + कोट 5ml pemafix + 38 लीटर E3 पानी प्रति 5ml melafix).
भाग 3. प्रतिनिधि परिणाम
जब सही ढंग से प्रदर्शन किया, यह संभव है इंजेक्शन सामग्री कल्पना अगर यह कुछ रास्ते में चिह्नित किया गया है. उदाहरण के लिए, टीजी (ग्लोबिन: GFP) के लाल रक्त कोशिकाओं को एक फ्लोरोसेंट विच्छेदन इंजेक्शन के बाद जल्द ही के रूप में प्राप्तकर्ता कैस्पर मछली की vasculature में घूम आंकड़ा 2 में दिखाया गया है खुर्दबीन के नीचे देखा जाना चाहिए. इसी तरह, एक 70kDa dextran, टेक्सास रेड ® संयुग्मित इंजेक्शन रेट्रो - कक्षीय इंजेक्शन के बाद तुरंत पारदर्शी मछली (3 आंकड़ा) की vasculature में visualized किया जा सकता है. टीजी (β-actin: GFP) से प्रतिदीप्त गुर्दे की कोशिकाओं दाता मछली भी विकिरणित कैस्पर प्राप्तकर्ता मछली में रेट्रो orbitally इंजेक्शन जा सकता है . इन कोशिकाओं अंततः प्राप्तकर्ता मज्जा (4a आंकड़ा) घर और तो कर सकते हैं होगा पर जाने के लिए कई सप्ताह (4b आंकड़ा) के बाद गुर्दे की जनसंख्या फिर से बढ़ा.
यदि इंजेक्शन भी उथले है या सुई के कोण शिरापरक रेट्रो कक्षीय साइनस गुहा नजरअंदाज, इंजेक्शन सामग्री visualized किया जा आंख के आसपास पूलिंग या इसे से बाहर बह हो सकता है. वैकल्पिक रूप से, अगर इंजेक्शन भी गहरी है, मछली ऊतकों को नुकसान या अत्यधिक रक्तस्राव का अनुभव है, हालांकि वे अभी भी ठीक हो सकता है हो सकता है. जब सही ढंग से प्रदर्शन किया, रेट्रो कक्षीय इंजेक्शन के बाद मृत्यु दर कुल इंजेक्शन मछली और खून को प्रसव की सफलता के कम से कम 5% कुल इंजेक्शन मछली के 90% से अधिक होना चाहिए किया जाना चाहिए.
चित्रा 1: रेट्रो कक्षीय इंजेक्शन तकनीक का चित्रण. मछली की दाहिनी आंख जिसमें सात ओ घड़ी की स्थिति सही इंजेक्शन हाजिर करने के लिए मेल खाती है एक एनालॉग घड़ी के रूप में प्रतिनिधित्व किया है.
चित्रा 2: टीजी (ग्लोबिन: GFP) के लाल रक्त कोशिकाओं रेट्रो कक्षीय इंजेक्शन के बाद तीन दिन एक वयस्क कैस्पर मछली की पूंछ की vasculature में परिसंचारी.
चित्रा 3: के सफल इंजेक्शन 70kDa टेक्सास रेड संयुग्मित dextran ® डाई पारदर्शी वयस्क मछली, कैस्पर में फ्लोरोसेंट vasculature उत्पादन और आसानी से मानक पूरे जानवर प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर देखा के रूप में इस्तेमाल किया.
चित्रा 4a: रेट्रो कक्षीय टीजी (β-actin: GFP) से पूरे गुर्दे मज्जा की कोशिकाओं के इंजेक्शन के बाद तीन दिनों दाता मछली, कोशिकाओं विकिरणित वयस्क कैस्पर प्राप्तकर्ता मछली के गुर्दे मज्जा के लिए घर वापस आना visualized किया जा सकता है .
संख्या4b: रेट्रो कक्षीय टीजी (β-actin: GFP) से पूरे गुर्दे मज्जा की कोशिकाओं के इंजेक्शन के बाद चार सप्ताह के दाता मछली, हरी दाता पूरे गुर्दे मज्जा की कोशिकाओं के साथ प्राप्तकर्ता गुर्दे की repopulation विकिरणित वयस्क कैस्पर प्राप्तकर्ता मछली में visualized किया जा सकता है.
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Discussion
रेट्रो - कक्षीय वयस्क zebrafish में इंजेक्शन मृत्यु दर के कम घटना के साथ खून इंजेक्शन सामग्री की डिलीवरी की उच्चतम क्षमता देता है. इंजेक्शन मौके की प्रकृति के कारण, पंचर करने के लिए जल्दी ठीक है, संक्रमण और रक्त की हानि की राशि की घटना कम दिखाई देता है. साइट भी बार बार दवाओं के दैनिक इंजेक्शन के लिए एक कम समय के दौरान हो सकता है इंजेक्शन उदाहरण के लिए, जा.
वयस्क मछली में परंपरागत उपचार विधियों बस जो मछली में डूब रहे हैं और ब्याज की दवा युक्त पानी में भिगो के लिए दवाओं की बड़ी मात्रा में खरीदा जाना चाहिए. हालांकि, अगर दवा सीधे जानवर के खून में अंतःक्षिप्त है, एक बहुत छोटी मात्रा में उपचार के लिए आवश्यक है, जिससे प्रयोगात्मक लागत कम है. कुछ यौगिकों कि बहुत बड़े हैं कुछ पेप्टाइड्स के मामले में भिगोने, के माध्यम से मछली परिसंचरण में प्रवेश के लिए, रेट्रो - कक्षीय इंजेक्शन भी फायदेमंद हो सकता है.
इसके अलावा, आरओ इंजेक्शन के बाद से तेजी से और वयस्क मछली में intracardiac इंजेक्शन तकनीक की तुलना में आसान है, आरओ इंजेक्शन के एक और आवेदन वयस्क रासायनिक आनुवंशिक स्क्रीनिंग शामिल हो सकते हैं. इस प्रकार, रेट्रो - कक्षीय इंजेक्शन बहुत zebrafish अनुसंधान की आवश्यकता रासायनिक या रासायनिक वितरण की सुविधा सकता है.
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Acknowledgments
इस काम के हॉवर्ड ह्यूजेस मेडिकल इंस्टीट्यूट और भ्रूण hematopoiesis के अध्ययन के लिए NIH से एक अनुदान द्वारा समर्थित है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma-Aldrich | 2106 | Preweighed vial of 300 USP units |
| Tricaine-S | Western Chemical | MS-222 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Invitrogen | 14190-144 | |
| Dextran, Texas Red® | Molecular Probes, Life Technologies | D1830 | |
| E3 | 5mM NaCl 0.17 mM Kcl 0.33 mM CaCl2 0.33 mM MgSO2 |
||
| Microliter Syringe | Hamilton Co | 80300 | 701N 10uL SYR (26s/2”/2) |
References
- Steel, C. D., Stephens, A. L., Hahto, S. M., Singletary, S. J., Ciavarra, R. P. Comparison of the lateral tail vein and the retro-orbital venous sinus as route of intravenous drug delivery in a transgenic mouse model. Lab Animal. 37, 26-32 (2008).
- Pinkerton, W., Webber, M. A method of injecting small laboratory animals by the ophthalmic plexus route. Proc. Soc. Exp. Bio. Med. 116, 959-961 (1964).
- White, R. M., Sessa, A. S., Burke, C., Bowman, T., LeBlanc, J., Ceol, C., Bourque, C., Dovey, M., Goessling, W., Burns, C. E., Zon, L. I. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2, 183-189 (2008).
- LeBlanc, J., Bowman, T. V., Zon, L. I. Transplantation of whole kidney marrow in adult zebrafish. J. Vis. Exp. , (2007).
