Summary
Aqui nós mostramos como fazer retro-orbital injeção em peixe-zebra adulto.
Abstract
Tratamento medicamentoso de animais inteiros é uma ferramenta essencial em qualquer sistema modelo para farmacológicos e químicos estudos genéticos. Injecção intravenosa (IV) é muitas vezes a forma mais eficaz e não invasivo de transporte de um agente de interesse. No peixe-zebra (
Protocol
Parte 1. Preparação de material de injecção
- Tg (globina: GFP) células:
- Sangrar peixes doadores adultos usando ponteira 10ul revestido em heparina (1unit/ul) para pescar punção por trás de emalhar.
- Aspirar glóbulos vermelhos e dispensar em tampão celular (0.9x PBS + 5% de SFB + 1% Pen / Strep).
- Suspensão de células filtro sobre malha 40uM e determinar a concentração de células usando hemocitômetro como descrito por LeBlanc et al.
- Spin down e ressuspender em tampão celular na concentração desejada de tal forma que o volume de injeção final não é mais do que 5ul. Aqui nós injetar 1,5-2000000 células / destinatário.
- Para o, dextran Texas Red ®, dissolver o corante em DPBS para uma concentração final de injecção de 10-12 mg / mL. Plano para injetar 4 uL por peixe.
Parte 2. Injeção
- Anestesiar peixes em tricaina (4.2ml (4mg/ml) peixes de água tricaine/100ml).
- Lavar seringa Hamilton 3-4 vezes antes da injeção utilizando etanol 70%. Enxágüe 3-4 vezes com DPBS 0.9x.
- Coloque os peixes lado dorsal para cima e virado para a direita na esponja úmida.
- Segure a seringa Hamilton com a mão direita e com o dedo indicador sobre o êmbolo. Suavemente estabilizar o corpo do peixe com a mão esquerda.
- Posição da agulha com o bisel voltado para cima de tal forma que se o olho do peixe s fosse um relógio, a agulha seria apontar para a posição 7:00 e em um ângulo de 45 graus para o peixe (figura 1).
- Inserir a agulha delicadamente 1-2 mm em posição 7:00 e lentamente o êmbolo.
- Permitir que os peixes na água para recuperar E3 fresco.
- Lavar agulha, como descrito acima, entre as injeções de reagentes diferentes.
- Solução Flick célula para ressuspender as células a cada poucos minutos para evitar aglomeração de células.
- Manter o fluxo de peixe por 1 semana com mudanças de água diariamente para evitar a infecção. Mantemos peixe na água UTI para esse período (10 ml + casaco Estresse pemafix 5mL + melafix 5mL por 38 litros de água E3).
Parte 3. Resultados representante
Quando realizada corretamente, é possível visualizar material injetado, se tiver sido rotulado de alguma forma. Por exemplo, Tg (globina: GFP), as células vermelhas do sangue deve ser visto sob um microscópio fluorescente dissecção circulando na vasculatura do destinatário peixes casper logo após a injeção, como mostrado na figura 2. Da mesma forma, a injeção de um dextran 70kDa, conjugado com Texas Red ® pode ser visualizado na vasculatura de peixe transparente imediatamente após a injeção de retro-orbital (figura 3). Células de rim fluorescente de Tg (β-actina: GFP) de peixes doadores também podem ser injetados retro-orbital em peixes irradiados casper destinatário. Estas células acabará casa até a medula destinatário (figura 4a) e pode então ir para repovoar o rim depois de várias semanas (figura 4b).
Se a injecção é muito raso ou o ângulo da agulha ignora a retro-orbital cavidade do seio venoso, material injetado pode ser visualizado pooling em torno do olho ou saindo dela. Alternativamente, se a injeção é muito profundas, os peixes podem sofrer danos tecido ou sangramento excessivo, mas eles ainda podem se recuperar. Quando realizada corretamente, a mortalidade após retro-orbital injecção deve ser inferior a 5% do peixe total injetado e sucesso de entrega para a corrente sanguínea deve ser superior a 90% do peixe total injetado.
Figura 1: Ilustração de retro-orbital técnica de injeção. O olho direito do peixe é representado como um relógio analógico em que os sete posição do relógio o corresponde ao local de injeção correta.
Figura 2: Tg (globina: GFP) glóbulos vermelhos circulantes na vasculatura da cauda de um peixe adulto casper três dias depois de retro-orbital injeção.
Figura 3: A injeção de sucesso de um dextran 70kDa conjugado com Texas Red ® usado como corante fluorescente produz vasculatura no peixe adulto transparente, casper e é facilmente visualizado utilizando microscopia de fluorescência padrão todo animal.
Figura 4a: Três dias após retro-orbital injeção de células de rim de todo medula Tg (β-actina: GFP) de peixes doadores, as células podem ser visualizados homing para a medula renal de peixes irradiados receptor adulto casper.
Figura4b: Quatro semanas após a retro-orbital injeção de células de rim de toda a medula da Tg (β-actina: GFP) de peixes doadores, o repovoamento do rim destinatário com células da medula do doador verde toda rim pode ser visualizado na irradiados peixes receptor adulto casper.
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Discussion
Retro-orbital injeção em peixe-zebra adulto dá a maior eficiência de entrega de material injetado na corrente sanguínea com a menor incidência de mortalidade. Devido à natureza do local de injeção, a punção parece curar rapidamente, diminuindo a ocorrência de infecção e da quantidade de perda de sangue. O site pode até ser injetado repetidamente durante um curto período de tempo para injeções diárias de medicamentos, por exemplo.
Grandes quantidades de droga deve ser comprado por métodos tradicionais de tratamento em peixes adultos em que os peixes são simplesmente imersos e embebidos em água contendo a droga de interesse. No entanto, se a droga é injetada diretamente na corrente sanguínea do animal, uma quantidade muito menor é necessária para o tratamento, diminuindo assim os custos experimental. Para certos compostos que são grandes demais para entrar na circulação dos peixes através de imersão, no caso de certos peptídeos, retro-orbital de injeção também pode ser vantajosa.
Além disso, como injeção de RO é mais rápido e mais fácil do que técnicas de injeção intracardíaca nos peixes adultos, uma outra aplicação de injeção pode incluir RO triagem química adulto genética. Assim, retro-orbital injeção pode facilitar muito a pesquisa zebrafish exigindo a entrega de produtos químicos ou químicos.
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Acknowledgments
Este trabalho é apoiado por Howard Hughes Medical Institute e uma concessão do NIH para o estudo da hematopoiese embrionária.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma-Aldrich | 2106 | Preweighed vial of 300 USP units |
| Tricaine-S | Western Chemical | MS-222 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Invitrogen | 14190-144 | |
| Dextran, Texas Red® | Molecular Probes, Life Technologies | D1830 | |
| E3 | 5mM NaCl 0.17 mM Kcl 0.33 mM CaCl2 0.33 mM MgSO2 |
||
| Microliter Syringe | Hamilton Co | 80300 | 701N 10uL SYR (26s/2”/2) |
References
- Steel, C. D., Stephens, A. L., Hahto, S. M., Singletary, S. J., Ciavarra, R. P. Comparison of the lateral tail vein and the retro-orbital venous sinus as route of intravenous drug delivery in a transgenic mouse model. Lab Animal. 37, 26-32 (2008).
- Pinkerton, W., Webber, M. A method of injecting small laboratory animals by the ophthalmic plexus route. Proc. Soc. Exp. Bio. Med. 116, 959-961 (1964).
- White, R. M., Sessa, A. S., Burke, C., Bowman, T., LeBlanc, J., Ceol, C., Bourque, C., Dovey, M., Goessling, W., Burns, C. E., Zon, L. I. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2, 183-189 (2008).
- LeBlanc, J., Bowman, T. V., Zon, L. I. Transplantation of whole kidney marrow in adult zebrafish. J. Vis. Exp. , (2007).
