Summary
Här visar vi hur du gör retro-orbital injektionsvätska till vuxna zebrafisk.
Abstract
Läkemedelsbehandling av hela djur är ett viktigt verktyg i alla modellsystem för farmakologiska och kemiska genetiska studier. Intravenös (IV) injektion är ofta den mest effektiva och icke-invasiv form av leverans av en agent av intresse. I zebrafisk (
Protocol
Del 1. Beredning av injektion material
- Tg (globin: GFP) celler:
- Utfallande vuxen donator fiska med 10ul pipettspetsen överdragna med heparin (1unit/ul) för att punktera fisk bakom Gill.
- Aspirera röda blodkroppar och fördela i cell buffert (0.9x PBS + 5% FBS + 1% Penna / Strep).
- Filtrera cellsuspension över 40uM mesh och bestämma koncentrationen av celler genom att använda hemocytometer som tidigare beskrivits av LeBlanc et al.
- Spinn ner och återsuspendera i cell buffert på önskad koncentration så att slutlig injektionsvolym är inte mer än 5ul. Här har vi injicera 1,5 till 2.000.000 celler / mottagare.
- För dextran, Texas Red ®, lösa upp färg i DPBS för en slutlig injektion koncentration av 10-12 mg / ml. Plan för att injicera 4 uL per fisk.
Del 2. Injektion
- Bedöva fisk i tricaine (4.2ml (4mg/ml) tricaine/100ml fisk vatten).
- Tvätta Hamilton spruta 3-4 gånger före injektion med 70% etanol. Skölj 3-4 gånger med 0.9x DPBS.
- Placera fisken ryggsidan uppåt och vänd åt höger på fuktig svamp.
- Håll Hamilton sprutan med din högra hand och med pekfingret på kolven. Försiktigt stabilisera kroppen av fisk med vänster hand.
- Placera nålen med den fasade vänd uppåt så att om fisken öga var en klocka, skulle nålen pekar på 7:00 position och i 45 graders vinkel mot fisk (figur 1).
- För försiktigt in kanylen 1-2 mm i 7:00 position och sakta pressa kolven.
- Låt fisken att återhämta sig i färskt E3 vatten.
- Tvätta nål, som beskrivits ovan, mellan injektioner av olika reagenser.
- Flick cell lösning för att resuspendera cellerna med några minuters mellanrum för att förhindra cell klibbar.
- Håll fiska utanför flödet för en vecka med dagliga vattenbyten för att undvika infektion. Vi håller fisk i ICU vatten för denna period (10mL Stress päls + 5 ml pemafix + 5 ml melafix per 38 liter E3 vatten).
Del 3. Representativa resultat
När de utförs på rätt sätt, är det möjligt att visualisera injicerade materialet om det har märkts på något sätt. Till exempel Tg (globin: GFP) ska röda blodkroppar ses i ett fluorescerande dissektion mikroskop som cirkulerar i kärlsystemet av mottagare casper fisk snart efter injektionen som visas i figur 2. På samma sätt kan injektion av en 70kDa dextran, konjugerat till Texas Red ® visualiseras i kärlsystemet genomskinliga fiskar omedelbart efter retro-orbital injektion (figur 3). Fluorescerande njure celler från Tg (β-aktin: GFP) givare fisk kan också injiceras retro-orbitally i bestrålat Casper mottagaren fisk. Dessa celler kommer så småningom hem till mottagaren märgen (figur 4a) och kan sedan gå vidare till återbefolka njuren efter flera veckor (figur 4b).
Om injektion är för grunt eller vinkeln på nålen kringgår retro-orbital hålighet vensinustrombos kan injiceras materialet visualiseras sammanslagning runt ögat eller rinner ut av det. Alternativt, om injektionen blir för djup, får fiska uppleva vävnadsskada eller kraftig blödning, men de kan ändå återhämta sig. När utförs korrekt, bör dödlighet efter retro-orbital injektion vara mindre än 5% av det totala injicerade fisk och framgång leverans till blodet bör vara större än 90% av det totala injiceras fisk.
Figur 1: Illustration av retro-orbital injektionsteknik. Den högra öga fisken representeras av en analog klocka där 7:00 position motsvarar rätt injektionen plats.
Figur 2: Tg (globin: GFP) röda blodkroppar som cirkulerar i kärlsystemet av svansen av en vuxen casper fisk tre dagar efter retro-orbital injektion.
Figur 3: Framgångsrik injektion av en 70kDa dextran konjugerat till Texas Red ® används som färgämne ger fluorescerande kärlen i det genomskinliga vuxen fisk, Casper och är lätt visas med normala hela mikroskopi djur fluorescens.
Figur 4a: Tre dagar efter retro-orbital injektion av hela celler njure märg från Tg (β-aktin: GFP) givare fisk, kan cellerna visualiseras målsökande till njuren märgen av bestrålat vuxna casper mottagaren fisk.
Figur4b: Fyra veckor efter retro-orbital injektion av hela celler njure märg från Tg (β-aktin: GFP) givare fisk, återplantering av mottagaren njurarna med gröna donator hela celler njure märgen kan visualiseras i bestrålade vuxna Casper mottagaren fisk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Retro-orbital injektionsvätska till vuxna zebrafisk ger den högsta effektiviteten i leveransen av injicerade materialet till blodomloppet med den lägsta förekomsten av dödlighet. På grund av arten av injektionen plats, verkar punktering att läka snabbt, minska förekomsten av infektioner och mängden blod förlust. Webbplatsen kan även vara flera gånger injiceras under en kort tid för dagliga injektioner av läkemedel, till exempel.
Stora mängder narkotika måste köpas för traditionella behandlingsmetoder i vuxen fisk där fisken är helt enkelt nedsänkta och indränkt i vatten innehållande drogen av intresse. Men om läkemedlet injiceras direkt i blodet av djur, är en mycket mindre mängd som krävs för behandling, och därmed minska experimentell kostnader. För vissa föreningar som är för stora för att komma in i fisken cirkulation genom blötläggning, i fråga om vissa peptider, får retro-orbital injektionen också en fördel.
Vidare, eftersom RO injektion är snabbare och enklare än intrakardiell injektionsteknik i vuxen fisk kan en annan tillämpning av RO injektion inkluderar vuxna kemiska genetisk screening. Således kan retro-orbital injektion underlätta avsevärt för zebrafisk forskning kräver kemiska eller kemiska leverans.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av Howard Hughes Medical Institute och ett bidrag från NIH för studiet av embryonala blodbildningen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma-Aldrich | 2106 | Preweighed vial of 300 USP units |
| Tricaine-S | Western Chemical | MS-222 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Invitrogen | 14190-144 | |
| Dextran, Texas Red® | Molecular Probes, Life Technologies | D1830 | |
| E3 | 5mM NaCl 0.17 mM Kcl 0.33 mM CaCl2 0.33 mM MgSO2 |
||
| Microliter Syringe | Hamilton Co | 80300 | 701N 10uL SYR (26s/2”/2) |
References
- Steel, C. D., Stephens, A. L., Hahto, S. M., Singletary, S. J., Ciavarra, R. P. Comparison of the lateral tail vein and the retro-orbital venous sinus as route of intravenous drug delivery in a transgenic mouse model. Lab Animal. 37, 26-32 (2008).
- Pinkerton, W., Webber, M. A method of injecting small laboratory animals by the ophthalmic plexus route. Proc. Soc. Exp. Bio. Med. 116, 959-961 (1964).
- White, R. M., Sessa, A. S., Burke, C., Bowman, T., LeBlanc, J., Ceol, C., Bourque, C., Dovey, M., Goessling, W., Burns, C. E., Zon, L. I. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2, 183-189 (2008).
- LeBlanc, J., Bowman, T. V., Zon, L. I. Transplantation of whole kidney marrow in adult zebrafish. J. Vis. Exp. , (2007).
