Summary
Qui vi mostriamo come fare retro-orbitale iniezione in zebrafish adulti.
Abstract
Trattamento farmacologico degli animali tutto è uno strumento essenziale in qualsiasi sistema modello per studi di genetica e chimica farmacologica. Per via endovenosa (ev) è spesso la forma più efficace e non invasiva di consegna di un agente di interesse. Nel pesce zebra (
Protocol
Parte 1. Preparazione del materiale di iniezione
- Tg (globina: GFP) celle:
- Bleed pesce adulto donatore utilizzando punta della pipetta 10ul rivestito in eparina (1unit/ul) a pescare puntura dietro branchia.
- Aspirare globuli rossi e dispensare nel buffer di cella (0.9x PBS + 5% FBS + 1% Pen / Strep).
- Cellula sospensione filtro su mesh 40uM e determinare la concentrazione di cellule utilizzando emocitometro come precedentemente descritto da LeBlanc et al.
- Spin down e risospendere in buffer cella a concentrazione desiderata in modo tale che il volume di iniezione finale non è più di 5UL. Qui iniettare 1,5-2000000 cellule / destinatario.
- Per le, destrano Texas Red ®, sciogliere il colorante in DPBS per una concentrazione di iniezione finale di 10-12 mg / mL. Piano per iniettare 4 uL per pesce.
Parte 2. Iniezione
- Anestetizzare pesce in tricaine (4.2ml (4mg/ml) tricaine/100ml pesci d'acqua).
- Lavare Hamilton siringa 3-4 volte prima dell'iniezione utilizzando etanolo al 70%. Lavare 3-4 volte con DPBS 0.9x.
- Luogo pesce lato dorsale e rivolta a destra sulla spugna umida.
- Tenere la siringa Hamilton con la mano destra e con il dito indice sullo stantuffo. Delicatamente stabilizzare il corpo del pesce con la mano sinistra.
- La posizione della lancetta con lo smusso rivolto verso l'alto in modo tale che se l'occhio del pesce s fosse un orologio, l'ago sarebbe indicando la posizione 7:00 e con un angolo di 45 gradi per il pesce (figura 1).
- Inserire delicatamente l'ago 1-2 mm in posizione 07:00 e lentamente spingere il pistone.
- Permettono di recuperare il pesce in acqua dolce E3.
- Lavare ago, come descritto sopra, tra le iniezioni di reagenti diversi.
- Flick soluzione cellula per risospendere le cellule ogni pochi minuti per evitare grumi di cellule.
- Mantenere il flusso di pesce per 1 settimana con cambi d'acqua ogni giorno per evitare l'infezione. Noi mantenere i pesci in acqua terapia intensiva per questo periodo (cappotto stress da 10 ml + 5 ml + pemafix melafix 5mL per 38 litri di acqua E3).
Parte 3. Rappresentante Risultati
Quando eseguito correttamente, è possibile visualizzare materiale iniettato se è stato etichettato in qualche modo. Per esempio, Tg (globina: GFP) globuli rossi dovrebbe essere visto sotto un microscopio a fluorescenza dissezione circola nei vasi dei pesci destinatario casper subito dopo l'iniezione, come illustrato in figura 2. Allo stesso modo, l'iniezione di un destrano 70kDa, coniugato con Texas Red ® possono essere visualizzati nel sistema vascolare del pesce trasparente immediatamente successivo retro-orbitale di iniezione (figura 3). Cellule renali fluorescenti da Tg (β-actina: GFP) pesci donatore può anche essere iniettato retro-orbitalmente in pesci irradiati destinatario casper. Queste cellule finalmente a casa per il midollo destinatario (figura 4a) e può quindi andare a ripopolare il rene dopo diverse settimane (figura 4b).
Se l'iniezione è troppo bassa o l'angolo dell'ago bypassa il retro-orbitale cavità dei seni venosi, materiale iniettato può essere visualizzata pooling intorno all'occhio o che scorre fuori di esso. In alternativa, se l'iniezione è troppo profondo, pesce possibile che si verifichino danni ai tessuti o sanguinamento eccessivo, anche se può ancora recuperare. Quando eseguito correttamente, la mortalità dopo retro-orbitale di iniezione deve essere inferiore al 5% del totale pesce iniettato e il successo di consegna alla circolazione sanguigna dovrebbe essere superiore al 90% del totale pesce iniettato.
Figura 1: Illustrazione di retro-orbitale tecnica di iniezione. L'occhio destro del pesce è rappresentato come un orologio analogico in cui l'orologio sette o posizione corrisponde al punto d'iniezione corretta.
Figura 2: Tg (globina: GFP) globuli rossi circolanti nei vasi della coda di un pesce adulto casper tre giorni dopo la retro-orbitale iniezione.
Figura 3: iniezione di successo di una 70kDa destrano coniugato con Texas Red ® usato come colorante fluorescente produce vascolarizzazione nei pesci adulti trasparente, Casper ed è facilmente visualizzati utilizzando standard di tutta la microscopia a fluorescenza animale.
Figura 4a: Tre giorni successivi retro-orbitale iniezione di cellule intere midollo rene da Tg (β-actina: GFP) pesci donatore, le cellule possono essere visualizzati homing al midollo reni del combustibile irraggiato pesce destinatario casper adulti.
Figura4b: Quattro settimane dopo la retro-orbitale iniezione di cellule intere midollo rene da Tg (β-actina: GFP) pesci donatore, il ripopolamento del rene destinatario con verde cellule renali di tutto midollo del donatore possono essere visualizzati in irradiati pesce destinatario casper adulti.
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Discussion
Retro-orbitale iniezione in zebrafish adulto offre la massima efficienza della consegna del materiale iniettato alla circolazione sanguigna con la più bassa incidenza di mortalità. A causa della natura del punto di iniezione, la puntura sembra guarire in fretta, diminuendo l'insorgenza di infezioni e la quantità di perdita di sangue. Il sito può anche essere iniettato ripetutamente nel corso di un breve periodo di tempo per iniezioni giornaliere di farmaci, per esempio.
Grandi quantità di farmaci devono essere acquistati per i metodi tradizionali di trattamento di pesci adulti in cui i pesci sono semplicemente immersi e immersi in acqua contenente il farmaco di interesse. Tuttavia, se il farmaco viene iniettato direttamente nel sangue degli animali, una quantità molto più piccola è richiesto per il trattamento, riducendo i costi sperimentale. Per alcuni composti che sono troppo grandi per entrare nella circolazione pesce attraverso ammollo, nel caso di certi peptidi, retro-orbitale iniezione può essere anche vantaggiosa.
Inoltre, dato che l'iniezione RO è più veloce e più facile che le tecniche di iniezione intracardiaca nel pesce adulto, un'altra applicazione dell'iniezione RO possono includere lo screening per adulti chimica genetica. Così, retro-orbitale iniezione può facilitare notevolmente la ricerca zebrafish che richiedono la consegna chimica o chimica.
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Acknowledgments
Questo lavoro è supportato da Howard Hughes Medical Institute e una borsa di studio del NIH per lo studio della ematopoiesi embrionale.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma-Aldrich | 2106 | Preweighed vial of 300 USP units |
| Tricaine-S | Western Chemical | MS-222 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Invitrogen | 14190-144 | |
| Dextran, Texas Red® | Molecular Probes, Life Technologies | D1830 | |
| E3 | 5mM NaCl 0.17 mM Kcl 0.33 mM CaCl2 0.33 mM MgSO2 |
||
| Microliter Syringe | Hamilton Co | 80300 | 701N 10uL SYR (26s/2”/2) |
References
- Steel, C. D., Stephens, A. L., Hahto, S. M., Singletary, S. J., Ciavarra, R. P. Comparison of the lateral tail vein and the retro-orbital venous sinus as route of intravenous drug delivery in a transgenic mouse model. Lab Animal. 37, 26-32 (2008).
- Pinkerton, W., Webber, M. A method of injecting small laboratory animals by the ophthalmic plexus route. Proc. Soc. Exp. Bio. Med. 116, 959-961 (1964).
- White, R. M., Sessa, A. S., Burke, C., Bowman, T., LeBlanc, J., Ceol, C., Bourque, C., Dovey, M., Goessling, W., Burns, C. E., Zon, L. I. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2, 183-189 (2008).
- LeBlanc, J., Bowman, T. V., Zon, L. I. Transplantation of whole kidney marrow in adult zebrafish. J. Vis. Exp. , (2007).
