Summary
De sodio de sulfato de dextrano (DSS), administrada en el agua potable es un modelo murino estableció una lesión inflamatoria de la colitis aguda. Este protocolo describe el método para el tratamiento de DSS y la preparación de los tejidos.
Abstract
La colitis puede ocurrir por infecciones virales o bacterianas, ataque isquémico, o trastornos autoinmunes, colitis ulcerosa y en especial la variante de colon de la enfermedad de Crohn - Colitis de Crohn. Colitis aguda puede presentarse con dolor y distensión abdominal, mala absorción, diarrea, hematoquezia y moco en las heces. Estamos empezando a comprender las complejas interacciones entre el medio ambiente, la genética y la disfunción de la barrera epitelial en la enfermedad inflamatoria intestinal y los modelos animales de colitis han sido esenciales para avanzar en nuestra comprensión de esta enfermedad. Un modelo popular consiste en complementar el agua de bebida de los ratones con el sulfato de bajo peso molecular dextrano (DSS), que resulta en daño epitelial y una sólida respuesta inflamatoria en el colon de varios días
Protocol
Parte 1: Modelo de reparación de lesiones Colitis
- Peso inicial se debe obtener para cada ratón antes de comenzar el tratamiento DSS.
- Haga un 3% (w / v) de sulfato de dextrano sódico solución de sal en agua y filtrar con un filtro de acetato de 0,45 m de celulosa.
- Reemplazar el agua potable en la jaula del ratón con la solución de DSS 3% durante cuatro días. Los ratones no deben tener acceso a cualquier otra fuente de agua (es decir, la exclusión consejos colocado en los sistemas de riego automático).
- En el cuarto día, reemplazar la solución de DSS con agua por un período adicional de tres días, lo que permite una cierta recuperación del epitelio del colon. Los ratones se pesaron en el día cuatro con el fin de cuantificar las consecuencias sistémicas de la colitis. La pérdida de peso es común en lesiones graves.
- El día 7, peso y sacrificio de los ratones. Los ratones pueden ser sacrificados por sobredosis por inhalación de isoflurano, o institucionalmente, IACUC métodos aprobados.
Parte 2: La necropsia y recolección de Colón
- Exponer el lado ventral del ratón y las piernas seguro para garantizar el acceso sin obstáculos en el abdomen. Mojar el abdomen completamente con etanol al 70%.
- Tome la línea media del abdomen con una pinza el tejido y se extienden hacia arriba lo que acampaban en la piel. Utilice tijeras de punta fina para incidir en el abdomen lo que expone el contenido abdominal. Extender la incisión a la punta de la apófisis xifoides en la línea media y luego se extenderá a lo largo de la cara inferior de los márgenes costal bilateral.
- Identificar el intestino delgado, el ciego y colon. Diseccionar cuidadosamente / se burlan de los dos puntos del mesenterio rodea. Transecto del colon en la pelvis para liberar el colon distal y recto. Transecto de los dos puntos en el margen colonocecal para liberar el colon proximal. Se debe tener cuidado durante este proceso para no dañar el colon como la limpieza del colon será problemático si se produce una perforación.
- Utilizando una aguja 20G de alimentación y una jeringa de 10 ml, intubar y limpiar el colon con helado de PBS hasta que el efluente está completamente libre de heces.
- En este punto, si el análisis macroscópico con un microscopio de disección se desea, los dos puntos se puede fijar como "salchichas". Si el análisis histológico sólo se desea que pase a la Parte 4 "la fabricación de cilindros Suiza para el análisis histológico de colitis aguda".
Parte 3: Tratamiento como "salchichas" para el análisis macroscópico de todo el colon
- Es importante mantener la orientación correcta del colon, por lo tanto, mantenga el extremo distal del colon más cercano al operador. Corte dos piezas de sutura no absorbible (SP116 1,5 seda trenzada métricas), uno de aproximadamente 1 pulgada de largo, los otros 2 pulgadas.
- Utilice la pieza de 2 pulgadas de sutura para atar el extremo distal tan cerca de la margen posible sin dejar de mantener un buen sello.
- Coloque una aguja 20G de alimentación que contiene 5 ml de tampón fosfato 10% de formalina en el extremo proximal del colon. Vagamente atar el pedazo restante de sutura inmediatamente proximal a la bombilla de la aguja de alimentación. Sujete firmemente el colon en el bulbo de la aguja de alimentación y de infundir en formol hasta que el colon se expanda. Apriete el nudo de la sutura que se retira la aguja de alimentación, lo que deja la infusión, colon ampliado como una "salchicha".
- Llenar un tubo cónico de 15 ml con tampón fosfato 10% de formol y el lugar de los dos puntos en el tubo. Fijar durante 24 horas.
- Retirar la formalina y reemplazar con un 70% EtOH durante una 24 horas adicionales. (Los dos puntos se pueden almacenar en un 70% EtOH indefinidamente a temperatura ambiente.)
- Quitar el colon desde el tubo cónico y cortar los hilos en cada extremo con un bisturí, con cuidado de no dañar el colon. Recuerde que el extremo distal tiene el mayor trozo de cuerda. Corte longitudinal de la porción distal de extremo proximal del colon de manera que forme una hoja larga. En este punto, el colon puede ser visto bajo un microscopio de disección.
Parte 4: la fabricación de cilindros Suiza para el análisis histológico de colitis aguda
- Es importante mantener la orientación correcta del colon, por lo tanto, mantenga el extremo distal del colon más cercano al operador.
- Medir la longitud del colon. Esta medida es otro indicador de la gravedad de la lesión. Colitis aumenta el edema y se acorta la longitud del colon en general.
- Utilizando unas tijeras de punta fina, cortar longitudinalmente de distal a proximal final del colon. Use unas pinzas de punta fina para agarrar cualquiera de los bordes de la incisión y abrir lateralmente su forma de trabajo hacia distal-> proximal, lo que muestra el colon como una lámina plana.
- Rolling colon requiere un par de pinzas y una técnica a dos manos. Tome cualquiera de los bordes del margen distal con una pinza. Proceder a rodar de forma secuencial el colon mediante la rotación y la liberación de las pinzas de continuar con el borde proximal. Generando así una espiral con una tercera dimensión o "rodillo suizo".Para mantener la forma enrollada, sujete firmemente el rollo con unas pinzas y transectos con una aguja 27G1 / 2. Asegurar la aguja al doblar la aguja a medida que sale del rollo.
- Coloque el rollo en un casete de tejidos debidamente etiquetados y colocar en un frasco de tampón fosfato 10% de formalina a temperatura ambiente durante 24 horas para asegurar la fijación del tejido.
- Retirar la formalina y reemplazar con un 70% EtOH durante una 24 horas adicionales. (Los dos puntos se pueden almacenar en un 70% EtOH indefinidamente a temperatura ambiente.)
- Una vez que la muestra ha sido fijada, puede ser incluido en parafina, se cortaron y montaron en portaobjetos para su análisis histológico.
Parte 5: Resultados de Representante
El modelo DSS para la colitis aguda permite al investigador para obtener, corregir y analizar los dos puntos que la colitis aguda modelos. Cuando el brazo de gitano se corta y se monta, se debe formar una parte representativa de la totalidad del colon si se extiende adecuadamente (Figura 1). El rollo montado se puede teñir con H & E con el fin de determinar el grado de daño al colon, de la parte distal (interior) el fin de la proximal (exterior) final (Figura 2). La inmunohistoquímica también se puede realizar en el brazo de gitano para identificar y cuantificar los infiltrados inflamatorios. Si el método de la salchicha se ha realizado correctamente, los dos puntos fijos se dilatan y toda la superficie de la mucosa puede ser fácilmente manipulado y se observa bajo el microscopio de disección (Figura 3).
Figura 1. Correctamente ejecutado "brazo de gitano". (A) Los dos puntos se rueda desde la parte distal a proximal final, seccionado con una aguja y se asegura doblando el extremo de la aguja. Luego se coloca en una cinta de tejido para su fijación. (B) H & E manchadas sección 5 micras de un brazo de gitano a partir de los dos puntos de un ratón tratado con DSS (d = colon distal p = colon proximal).
Figura 2. DSS dos puntos tratados muestran signos de colitis aguda. La inflamación y el daño cripta son evidentes en el colon DSS-tratados en comparación con un control del agua tratada.
Figura 3. Un ejemplo de una "salchicha". La salchicha infundido con formol y se expandió por completo. Una ligera inclinación estará presente secundaria a la curvatura natural del colon. La salchicha abierta deben estar planos.
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Discussion
Este protocolo se puede modificar el modelo de lesión aguda, curación de las heridas, lesiones o procesos crónicos de colon.
Modificación de lesiones agudas:
Tratamiento DSS ad lib durante 4-6 días, seguido por el sacrificio inmediato
Lesión-reparación de Modificación:
Lesión con 4-6 días de tratamiento DSS seguido de un período de recuperación de 3-4 días y el sacrificio (como se describe en el protocolo anterior).
Colitis crónicas Modificación:
Los ratones se colocan en tres ciclos de cinco días de DSS del 3% con dieciséis días de recuperación entre cada ciclo. Los ratones son sacrificados después del período de descanso final de 16 días.
Hay varias cuestiones que los investigadores deben ser conscientes de este modelo:
- La variabilidad en la zona de la lesión: En nuestras manos, vemos un patrón de lesiones de predominio distal, con preservación relativa de la porción proximal del colon y el ciego. Otros han informado de predominio proximal más al patrón de la lesión.
- La variabilidad ambiental. Existe una gran variabilidad ambiental significativo. Es probable que esto, en parte, debido a las diferencias en la microflora intestinal, la dieta y otras consideraciones ambientales.
- Este modelo es ineficaz si DSS de alto peso molecular se utiliza (es decir, 500.000 Da).
- Hay una variabilidad considerable presión con este modelo de 4.
El análisis bioquímico de los dos puntos se puede realizar tomando muestras de los márgenes proximal o distal. Dependiendo de la gravedad de las lesiones que esto puede afectar su capacidad para generar una puntuación de la lesión histológica. En vivo BrdU para medir la proliferación puede lograrse mediante inyección intraperitoneal de 16,7 mg / kg BrdU 2 horas antes de su sacrificio seguido de α-BrdU IHC procesamiento.
Como alternativa a la "salchicha", los dos puntos se puede fijar completamente plana. Cubra el fondo de un recipiente Tupperware con papel Whatman y empapar el papel con 10% de tampón fosfato de formalina. Disecar el colon como se describe en la "Parte 2: La necropsia y recolección de Colón". Una vez más, mantener el extremo distal del colon más cercano al operador. Utilizando unas tijeras de punta fina, cortar longitudinalmente de distal a proximal final del colon. Con unas pinzas de punta fina comprender cualquiera de los bordes de la incisión y abrir lateralmente de trabajo, con lo que muestra el colon como una lámina plana. La transferencia de esta hoja plana en el papel pre-empapado Whatman. Cubrir el colon aplanado con otro pedazo de papel Whatman y húmedo con un 10% buffer fosfato formalina. El Whatman debe estar completamente cubierto en formol, pero no tanto que se levanta de su colon. Sellar el Tupperware y fijar, por 24 horas. Extirpar el colon desde el Tupperware y lo coloca en 10 ml de etanol al 70% en un tubo cónico de 15 ml. (Los dos puntos se pueden almacenar en un 70% EtOH indefinidamente a temperatura ambiente.)
Existen varios métodos para la cuantificación de lesiones del colon 5,6,7. Uno de los métodos, por ejemplo, utiliza una escala de múltiples parámetros como: la participación de la inflamación, medida, la regeneración, el daño cripta, y la participación del 8 por ciento.
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Disclosures
Los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices y normas establecidas por Vanderbilt IACUC.
Acknowledgments
Financiamiento proporcionado por el NIH (1 K08 DK080221-01) y los fondos de Vanderbilt de desarrollo institucional.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dextran Sulfate Sodium Salt | USB Corp., Affymetrix | 9011-18-1 | mol wt 40,000-50,000 |
| 10% Buffered Formalin Phosphate | Fisher Scientific | SF100-4 | |
| Isoflurane, USP | Phoenix Pharmaceuticals, Inc. | NDC 57319-474-06 | |
| TISSUE PATH Macrosette Cassettes | Fisher Scientific | 15182706 | |
| BD 10 ml Syringe | BD Biosciences | 309604 | |
| Ethyl Alcohol | Pharmco-AAPER | E190 | Dilute to 70% with distilled water |
| 20G Straight Feeding Needle | VWR international | 20068-612 | |
| 27G1/2 PrecisionGlide Needle | BD Biosciences | 305109 | |
| Dissecting Scissors Sharp/Blunt Tip | VWR international | 82027-588 | |
| Waugh Forceps | VWR international | 82027-428 | |
| Non-absorbable Suture | LOOK Surgical | SP116 | |
| Whatman Blotting Paper | VWR international | 28298-020 | Cut as needed |
| Nalgene Surfactant-Free Cellulose Acetate (SFCA) Filter | Cole-Parmer | EW-06731-2 | |
| Carbon fiber composites digital caliper | Fisher Scientific | 15-007-958 |
References
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