Summary
Dextran sulfate de sodium (DSS) administré dans l'eau potable est un modèle murin établie blessures inflammatoires de colite aiguë. Ce protocole décrit la méthode pour le traitement de DSS et la préparation des tissus.
Abstract
Colite peuvent survenir des infections virales ou bactériennes, ischémique ou de troubles auto-immunes; colite ulcéreuse et plus particulièrement la variante du côlon de la maladie de Crohn - maladie de Crohn. La colite aiguë peuvent présenter des douleurs abdominales et une distension, une malabsorption, diarrhée, rectorragies et de mucus dans les selles. Nous commençons à comprendre les interactions complexes entre l'environnement, la génétique et le dysfonctionnement de la barrière épithéliale inflammatoire modèles de maladies animales et l'intestin de colite ont été essentielles pour faire progresser notre compréhension de cette maladie. Un modèle populaire implique complétant l'eau potable des souris du sulfate de sodium à faible poids moléculaire Dextran (DSS), entraînant des dommages épithéliaux et une réponse robuste inflammatoires dans le côlon de plusieurs jours
Protocol
Partie 1: modèle de colite blessures-Réparation
- Poids à l'inclusion devrait être obtenue pour chaque souris avant de commencer le traitement du MAS.
- Faites un 3% (p / v) Sulfate de Dextran Sodium solution de sel dans l'eau et le filtre avec un filtre de 0,45 um d'acétate de cellulose.
- Remplacer l'eau potable dans la cage de la souris avec la solution DSS 3% pendant quatre jours. Les souris ne devraient pas avoir accès à toute autre source d'eau (à savoir l'exclusion des conseils mis sur les systèmes d'arrosage automatique).
- Le quatrième jour, remplacer la solution SSD avec de l'eau pour une période supplémentaire de trois jours, permettant une certaine reprise du côlon épithéliales. La souris devrait être pesé sur quatre jours afin de quantifier les conséquences systémiques de la colite. La perte de poids est commun avec des blessures graves.
- Au jour 7, peser et le sacrifice des souris. Les souris peuvent être euthanasiés par surdose par inhalation d'isoflurane, ou d'autres institutionnellement, IACUC méthodes approuvées.
Partie 2: autopsie et la récolte de Colon
- Exposer la partie ventrale de la souris et les jambes sécurisé afin d'assurer un libre accès à l'abdomen. Mouiller l'abdomen complètement avec 70% d'éthanol.
- Saisissez la ligne médiane de l'abdomen avec une pince tissus et s'étendent vers le haut donc tentes de la peau. Utilisez des ciseaux à pointe fine pour inciser l'abdomen exposant ainsi le contenu abdominal. Prolonger l'incision à la pointe de l'appendice xiphoïde à la ligne médiane puis s'étendent le long de la face inférieure de la marge côtière bilatéralement.
- Identifier l'intestin grêle, le caecum et du côlon. Soigneusement disséquer / taquiner le côlon du mésentère entoure. Transect du côlon profonde dans le bassin afin de libérer le côlon distal et du rectum. Transect du côlon à la marge colonocecal pour libérer le côlon proximal. Des précautions doivent être prises lors de ce processus pour ne pas endommager le colon que le nettoyage du côlon sera problématique si la perforation se produit.
- En utilisant une aiguille d'alimentation 20G et une seringue de 10 ml, intuber et rincer le côlon avec PBS glacé jusqu'à la éluat est totalement claire des selles.
- À ce stade, si l'analyse macroscopique avec un microscope à dissection est souhaitée, les colons peuvent être fixés comme «saucisses». Si l'analyse histologique est seulement désiré que de procéder à la partie 4 «Faire Rolls suisse pour l'analyse histologique de la colite aiguë".
Partie 3: Traitement de «saucisses» pour l'analyse macroscopique de l'ensemble du côlon
- Il est important de maintenir l'orientation correcte du côlon, par conséquent, garder l'extrémité distale du côlon proche de l'opérateur. Coupez deux morceaux de suture non résorbable (SP116 1,5 soie tressée métriques), l'un d'environ 1 pouce de longueur, les 2 autres pouces.
- Utilisez le morceau de 2 pouces de suture pour attacher l'extrémité distale aussi près que possible de la marge, tout en conservant une bonne étanchéité.
- Placer une aiguille 20G d'alimentation contenant 5 ml de 10% tamponné phosphate de formol dans l'extrémité proximale du côlon. Librement attacher le morceau restant de suture immédiatement en amont de l'ampoule de l'aiguille d'alimentation. Saisir fermement le côlon au niveau du bulbe de l'aiguille d'alimentation et laisser infuser le formol jusqu'à ce que le colon est élargi. Serrez le noeud de la suture que vous retirez l'aiguille d'alimentation, laissant ainsi la infuse, du côlon élargi comme une "saucisse".
- Remplir un tube de 15 ml conique avec 10% tamponnée de phosphate de formol et le lieu du côlon dans le tube. Correction pour les 24 heures.
- Décanter le formol et le remplacer par EtOH à 70% pour un 24 heures supplémentaires. (Colons peut être stockée dans EtOH à 70% indéfiniment à température ambiante.)
- Retirez le côlon du tube conique et couper les cordes à chaque extrémité avec un scalpel, en faisant attention à ne pas endommager le côlon. Rappelez-vous que l'extrémité distale a la plus longue ficelle. Couper longitudinalement à partir de l'extrémité distale à l'extrémité proximale du côlon de sorte qu'il forme une longue feuille. À ce stade, le côlon peut être considérée sous un microscope à dissection.
Partie 4: Rendre Rolls suisse pour l'analyse histologique de la colite aiguë
- Il est important de maintenir l'orientation correcte du côlon, par conséquent, garder l'extrémité distale du côlon proche de l'opérateur.
- Mesurez la longueur du côlon. Cette métrique est un autre indicateur de la gravité des blessures. Colite augmente l'œdème et raccourcit la durée du côlon globale.
- En utilisant des ciseaux à pointe fine, incisez longitudinalement de distal à l'extrémité proximale du côlon. Utilisez une pince à pointe bien à saisir un des bords de l'incision et ouverte latéralement travailler votre chemin distal-> proximale, affichant ainsi le colon comme un drap plat.
- Rouler le côlon nécessite une paire de pinces et d'une technique à deux mains. Saisissez l'un des bords de la marge distale avec une pince. Passez à rouler de façon séquentielle du côlon en tournant et en libérant les pinces de procéder à la marge proximale. Générant ainsi une spirale avec une troisième dimension ou "Roll suisse».Pour maintenir la forme enroulée, saisir le rouler fermement avec une pince et il transect avec une aiguille 27G1 / 2. Fixez l'aiguille par flexion de l'aiguille à sa sortie du rouleau.
- Placez le rouleau dans une cassette tissus étiquetés correctement et placez dans un pot de 10% tamponnée de phosphate de formol à température ambiante pendant 24 heures afin d'assurer la fixation des tissus.
- Décanter le formol et le remplacer par EtOH à 70% pour un 24 heures supplémentaires. (Colons peut être stockée dans EtOH à 70% indéfiniment à température ambiante.)
- Une fois l'échantillon a été fixé, il peut être inclus en paraffine, coupés et montés sur des lames pour l'analyse histologique.
Partie 5: Résultats Représentant
Le modèle SSD pour la colite aiguë permet au chercheur d'obtenir, corriger et analyser un colon qui la colite aiguë modèles. Quand le rouleau suisses est coupé et monté, il devrait former une tranche représentative de la totalité du côlon en cas de roulement correctement (figure 1). Le rouleau peut être montée colorés avec H & E, afin de déterminer l'étendue des dommages au côlon, de la partie distale (à l'intérieur) fin à la partie proximale (extérieur) fin (figure 2). L'immunohistochimie peut également être effectuée sur la liste suisse pour identifier et quantifier des infiltrats inflammatoires. Si la méthode la saucisse a été effectuée correctement, le côlon fixe sera dilaté et toute la surface des muqueuses peuvent être facilement manipulées et visualisées sous le microscope à dissection (figure 3).
Figure 1. Le bien-exécuté "roulé". (A) Le côlon est roulé de la partie distale de l'extrémité proximale, sectionné avec une aiguille et fixés par flexion de l'extrémité de l'aiguille. Il est ensuite placé dans une cassette de tissu pour la fixation. (B) H & E teinté section 5 um d'un rouleau Swiss made dans le côlon d'une souris traitée avec DSS (d = p = côlon distal du côlon proximal).
Figure 2. Virgules DSS traités montrent des signes de colite aiguë. Inflammation des dommages et la crypte sont apparentes dans le côlon DSS-traités par rapport à un contrôle de l'eau traitée.
Figure 3. Un exemple d'une «saucisse». La saucisse infusé avec du formol et complètement développé. Un léger angle seront présents secondaire à la courbure naturelle du côlon. La saucisse a ouvert doit être à plat.
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Discussion
Ce protocole peut être modifié pour modèle de lésion aiguë, blessure-réparation, ou chronique du côlon processus blessures.
Modification des traumatismes aigus:
Lib DSS ad traitement pendant 4-6 jours, suivie par le sacrifice immédiat
Blessure-Réparation de modification:
Blessure avec 4-6 jours de traitement DSS suivie par la période de récupération de 3-4 jours et le sacrifice (comme décrit dans le protocole ci-dessus).
Chronique de modification Colite:
Les souris sont placées sur trois cycles de cinq jours de DSS 3% avec seize jours de récupération entre chaque cycle. Les souris sont sacrifiées après la période de repos de 16 jours finale.
Il ya plusieurs questions que les chercheurs doivent être conscients de ce modèle:
- La variabilité dans le site de la blessure: Dans nos mains, nous voyons un type de blessure à prédominance distale, avec une épargne relative du côlon proximal et le caecum. D'autres ont signalé la prédominance proximale de la type de blessure.
- La variabilité de l'environnement. Il ya une importante variabilité de l'environnement. Cela est probablement, en partie, due à des différences dans la microflore intestinale, l'alimentation et autres considérations environnementales.
- Ce modèle est inefficace si haute DSS poids moléculaire est utilisé (c'est à dire 500 000 Da).
- Il existe une variabilité des tensions considérables avec ce modèle 4.
L'analyse biochimique du côlon peut être effectuée en prélevant des échantillons à partir des marges proximales ou distales. Selon la gravité des blessures ce qui peut influer sur votre capacité à générer un score de lésion histologique. In vivo marquage BrdU pour mesurer la prolifération peut être réalisé par injection intrapéritonéale de 16,7 mg / kg de BrdU 2 heures avant le sacrifice suivie par α-BrdU IHC traitement.
Comme une alternative à la "saucisse", le côlon peut être fixé complètement plat. Tapissez le fond d'un récipient Tupperware avec du papier Whatman et tremper le papier avec 10% tamponné phosphate de formol. Disséquer le côlon comme décrit dans "Partie 2: autopsie et la récolte de Colon". Encore une fois, garder l'extrémité distale du côlon proche de l'opérateur. En utilisant des ciseaux à pointe fine, incisez longitudinalement de distal à l'extrémité proximale du côlon. Avec de fines pinces à pointes saisir un des bords de l'incision et ouverte latéralement de travail, affichant ainsi le colon comme un drap plat. Transfert cette feuille à plat sur le papier pré-imbibé Whatman. Couvrir le côlon aplati avec un autre morceau de papier Whatman et humide avec 10% tamponné phosphate de formol. Le Whatman devrait être complètement couvert dans le formol, mais pas tant que cela soulève du côlon. Sceller le Tupperware et fixer pendant 24 heures. Retirez le côlon du Tupperware et le placer dans 10 ml d'éthanol à 70% dans un tube de 15 ml conique. (Colons peut être stockée dans EtOH à 70% indéfiniment à température ambiante.)
Il existe plusieurs méthodes pour quantifier les lésions coliques 5,6,7. Une méthode, par exemple, utilise une échelle multi-paramètres, notamment: l'implication inflammation, l'étendue, la régénération, les dommages crypte, l'implication et 8 pour cent.
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Disclosures
Expériences sur les animaux ont été effectuées en conformité avec les directives et les règlements stipulés par Vanderbilt IACUC.
Acknowledgments
Le financement accordé par le NIH (1 K08 DK080221-01) et les fonds de développement institutionnel Vanderbilt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dextran Sulfate Sodium Salt | USB Corp., Affymetrix | 9011-18-1 | mol wt 40,000-50,000 |
| 10% Buffered Formalin Phosphate | Fisher Scientific | SF100-4 | |
| Isoflurane, USP | Phoenix Pharmaceuticals, Inc. | NDC 57319-474-06 | |
| TISSUE PATH Macrosette Cassettes | Fisher Scientific | 15182706 | |
| BD 10 ml Syringe | BD Biosciences | 309604 | |
| Ethyl Alcohol | Pharmco-AAPER | E190 | Dilute to 70% with distilled water |
| 20G Straight Feeding Needle | VWR international | 20068-612 | |
| 27G1/2 PrecisionGlide Needle | BD Biosciences | 305109 | |
| Dissecting Scissors Sharp/Blunt Tip | VWR international | 82027-588 | |
| Waugh Forceps | VWR international | 82027-428 | |
| Non-absorbable Suture | LOOK Surgical | SP116 | |
| Whatman Blotting Paper | VWR international | 28298-020 | Cut as needed |
| Nalgene Surfactant-Free Cellulose Acetate (SFCA) Filter | Cole-Parmer | EW-06731-2 | |
| Carbon fiber composites digital caliper | Fisher Scientific | 15-007-958 |
References
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- Martinez, J. A. Deletion of Mtgr1 sensitizes the colonic epithelium to dextran sodium sulfate-induced colitis. Gastroenterology. 131 (2), 579-588 (2006).
- Moolenbeek, C., Ruitenberg, E. J. The "Swiss roll": a simple technique for histological studies of the rodent intestine. Lab Anim. 15 (1), 57-59 (1981).
- Mahler, M. Differential susceptibility of inbred mouse strains to dextran sulfate sodium-induced colitis. Am J Physiol. 274, G544-551 (1998).
- Aharoni, R. Immunomodulatory therapeutic effect of glatiramer acetate on several murine models of inflammatory bowel disease. J Pharmacol Exp Ther. 318 (1), 68-78 (2006).
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- Dieleman, L. A. Chronic experimental colitis induced by dextran sulphate sodium (DSS) is characterized by Th1 and Th2 cytokines. Clin Exp Immunol. 114 (3), 385-391 (1998).
