单从小鼠锥感光细胞吸录音

Summary

我们将展示如何从单一的鼠标采用吸电极锥记录闪光的反应。

Abstract

在视网膜上的杆和锥光感受器负责光检测。在黑暗中，环核苷酸门控技术（CNG）外段的渠道是开放的，允许离子流稳步向内穿过细胞膜，去极化的细胞。光线照射触发关闭的CNG通道，阻止外来阳离子电流的流动，从而导致细胞超极化。基于光感受器的极性，吸记录方法是发达国家在20世纪70年代，不像传统的膜片钳技术，不需要穿透质膜

Protocol

制作电极

1. 请使用微量拉马的记录电极和波兰与加热丝在显微镜下的电极。鼠标锥单细胞吸记录，电极尖端内径约6-7微米。
2. 准备参比电极。称取蒸馏水1％琼脂。在热水浴融化的琼脂溶液。用1％琼脂使用注射器填充玻璃吸液管（L = 100毫米，外径/ ID = 1/0.75毫米）。巩固在室温下10分钟的琼脂。
3. 切成半使用钻石刀的移液器。
4. 对照品溶液的参比电极浸泡至少24小时在4 ° C。

设立实验

5. 暗适应鼠标在一个黑色的笼过夜。
6. 准备100 mL的对照品溶液和1升灌注液（见下文）和过滤器的解决方案。
7. 溶解0.1％BSA和10毫米对照品溶液20毫升葡萄糖。
8. 校准使用光度计的光刺激的光线强度。
9. 安装在倒置显微镜下阶段的录音室。
10. 泡沫灌注液_，95％O 2 / 5％的_CO 2，在40℃水浴孵育增加的_CO 2的溶解度。该解决方案流量从瓶子的录音室，穿过一个陶瓷电阻升温到36-38 ° C。加热器应尽可能接近的录音室，最好在显微镜阶段，位于。
11. 流量调节器调整为约1-1.5毫升/分钟的流速。
12. 填写记录电极与参考解决方案。电极插入电极支架。确保有没有气泡在电极。安装探头放大器的持有人。持有人连接到一个吸痰器，这是内置部分矿物油填充电极支架侧端口连接管。油管的另一端连接到的矿物油的小型水库，其中的压力，可经口应用。
13. 参比电极连接的探头的另一极。绑定的热电偶（TC），参比电极。确保电极和TC提示并拢，使温度读数接近尽可能细胞。
14. 打开红外线照射，以可视化的电极。电极是由红外摄像机连接到一台监视器观看。中心电极上的视野和监测使用的微型机械臂图像。
15. 调整参考电极尖端接近（2-4毫米）的记录电极尖端的位置。
16. 调整加热器的直流电压，使溶液的温度大约是36-38 ° C。
17. 运行密封测试，以检查记录电极的电阻，通常大约900kΩ的。

隔离小鼠视网膜

18. 在昏暗的红灯下，安乐死与_CO 2和颈椎脱位，暗适应的鼠标。标记使用一个铁水火炬尖端轻微烧灼巩膜最背点的眼球。用剪刀Enucleate眼球。红外光下的所有后续程序进行。
19. Hemisect显微镜下用红外线照射和图像转换器的眼球。
20. 取下的角膜和晶状体。删除尽可能多的玻璃体。
21. 要记录的M -锥反应，除去眼罩⁴腹侧部分，用剃刀刀片从烧灼商标评审。
22. 剥离的视网膜色素上皮细胞层。
23. 拼合视网膜放在充满1-2毫升对照品溶液的培养皿的底部。
24. 切成小薄片，用刀片在视网膜和孵化用纯氧饱和光紧框的准备工作。

录音

25. 暂时关闭加热器。灌注流量切换到旁路管，以防止干燥室。
26. 漏大部分的解决方案中使用了一块Kimwipe组织分。传输视网膜悬挂录音室使用的玻璃吸管。
27. 等待约2分钟，直至视网膜片安定下来。重新灌注切换。打开加热器。
28. 红外线照射，打开可视化的准备工作。搜索的视网膜上腔躺在一块感光外分部伸出（见示例图）。轻轻地吸电极绘制内在段。在此配置中，几个原子核和内在段应绘制成电极。记录到一个明亮的闪光的光响应测试电极和一个锥体内节是否是在单元格是否是医治你的，判断的反应动力学和幅度。
29. 降低矿产水库适用于轻微的负电极尖端压力，以帮助保持在电极内段。
30. 一旦发现好的细胞，记录测试闪光的反应，从暗到明亮的强度。测试闪烁提供一个校准的光^刺激 5 。闪光的强度和波长是中性密度滤光片和窄带干涉滤光片，分别控制。测试闪光持续时间（20毫秒）是由计算机驱动的快门控制。

解决方案

1. 鼠标灌注液：112.5毫米氯化钠，MgCl _2的 2.4毫米，3.6毫米的氯化钾，1.2毫米氯化钙_2，10毫米HEPES（pH值7.4），碳酸氢钠₃ 20毫米，3毫米钠丁二酸钠谷氨酸，0.5毫米，0.02毫米EDTA，并10毫米的葡萄糖。
2. 鼠标记录电极的解决方案：140毫米氯化钠，氯化钾3.6毫米，2.4毫米MgCl _{2的氯化钙} ，1.2毫米，3毫米的HEPES（pH值7.4），0.02毫米EDTA。

Discussion

发展三十年前从感光细胞的单细胞吸录音。它使我们能够记录光刺激引起的不穿透细胞膜的跨膜电流变化。由于高的细胞与细胞间的粘附，它是很难隔离鼠标像两栖类动物的视网膜视网膜健康的单杆和锥，它是很难找到的比例很低（3％）和小尺寸，由于个人锥。段内（IS - 在）记录方法，记录从目前的几个感光器，其中可能包括一个圆锥体的内在环节，克服了这一困难。在野生型小鼠，反应应该是从杆和视锥细胞的结合。一个稳定的背景光可用于压制棒的反应。在这个视频中，我们使用Tα- / -视网膜，棒中，不能光刺激，因为他们缺乏G蛋白transducin ⁶的α-亚基。因此，光响应只从锥。