גיבוש חלבונים בממברנה עבור קביעת מבנה באמצעות Mesophases Lipidic

Summary

בזאת הוא תיאר את ההליך מיושם קבוצת מבניים ותפקודיים ביולוגיה קאפרי ממברנה להגדיר באופן ידני ניסויים התגבשות של חלבונים בממברנה ב mesophases lipidic.

Abstract

פרוטוקול מפורט של גיבוש חלבונים בממברנה באמצעות mesophases lipidic מתואר. לשיטה זו היו שונות המכונה בשלב מעוקב lipidic או בשיטת טווינה. השיטה הוכח להיות צדדי למדי, כי זה כבר נעשה שימוש כדי לפתור רנטגן קריסטלוגרפיים מבנים של חלבונים ו אוקריוטים פרוקריוטים, חלבונים, כי הם monomeric, הומו ו הטרו multimeric, chromophore המכילים chromophore ו-בחינם, אלפא סליל ו - בטא חבית חלבונים. ההצלחות האחרונות משתמש התגבשות טווינה הם האנושי מהונדסים Beta2-adrenergic ו אדנוזין A2A G-חלבון בשילוב קולטנים. הפרוטוקולים מוצגים לשחזר את החלבון לתוך הממברנה mesophase monoolein מבוססות, ואת להקמת crystallizations במצב הידני. צעדים נוספים בתהליך הכולל, כגון קצירת גביש, יש לטפל במאמרים וידאו עתידיות. הזמן הדרוש כדי להכין את mesophase חלבון טעון להקים צלחת התגבשות ידני הוא כשעה.

Protocol

חשוב להתמקד בתחום הביולוגיה המבנית תפקודית היא קרום ביולוגי (איור 1). קרום, העוטף את התא המשנה הסלולר האברונים כאשר נוכח, הוא מבנה מולקולרי דק רק שתי מולקולות השומנים ברחבי והוא משובץ חלבונים. מבנה ותפקוד כפי שהוחל שומנים וגם חלבונים הם בעלי עניין. עם זאת, ההתמקדות של מאמר זה היא מוגבלת חלבונים בממברנה.

הבנה טובה יותר של חלבונים בממברנה איך לתפקד ברמה המולקולרית הוא ביקש משתי סיבות. ראשית, יש את הסיפוק הרוחני לדעת איך הם עובדים. שנית, על ידי לדעת איך חלבון עובד, תמיד יש את האפשרות להיות מסוגל לתקן את זה צריך זה תקלה או שיפור או אפילו שינוי זה עבור יישומים מסוימים. עיצוב בסמים הוא תוצאה ברורה של סוג זה של עבודה. גישה אחת להבין כיצד חלבון קרום עובד ברמה המולקולרית הוא לקבוע את המבנה שלה. זה כרוך בהקמת המיקום בחלל 3 מימדי של אטומים כל, או לפחות לא כל אטומי מימן, המרכיבות את החלבון. השיטה שאנו משתמשים למטרה זו היא רנטגן קריסטלוגרפיה macromolecular (מושלם). תרשים 2 מציג דוגמה של חלבון ממברנה אשר נקבע באמצעות מבנה מושלם. איכות עקיפה גביש של החלבון נדרש לעשות מושלם.

ברור, ישנם צעדים רבים המעורבים בקביעת מבנה באמצעות קריסטלוגרפיה macromolecular. זו מתוארת באיור 3. בדרך כלל, אלה כוללים זיהוי יעד חלבון הממברנה ולאחר מכן ייצור, מטהרים לגבש אותה. מדידות השתברות מבוצעות על הגביש באמצעות בית או מקור רנטגן synchrotron. הנתונים מעובדים עקיפה מניב מפת צפיפות האלקטרונים כי הוא מצויד אז עם מודל מולקולרי. המודל, כאשר מעודן, יכול לשמש כדי לחקור את מנגנון הפעולה של החלבון ועל עיצוב המבנה מבוסס התרופה.

המוקד של מאמר זה היא להראות כיצד אנו מייצרים איכות עקיפה גבישים של חלבונים בממברנה באמצעות mesophases lipidic, על ידי מה שמכונה שיטת טווינה. סקירה האחרונות של השיטה והיקפה זמין Reference 1 (קאפרי, 2009). פרוטוקול צעד אחר צעד אנחנו נצטרף כאן מתואר הפניה 2 (קאפרי ו Cherezov, 2009).

תרשים זרימה המסכם את השלבים הכרוכים בזמן הנדרש להקמת במשפט טווינה חלבון קרום התגבשות מוצג באיור 4. מאמר זה מכסה את הצעדים האלה מוקף קווים אדומים מקווקו.

חלק 1: הכנת פלטות התגבשות

1. מיקום שקופיות מיקרוסקופ silanized על הספסל עבודה.
2. הסר את כיסוי הנייר המגן ממשטח אחד רצועת מחורר קלטת מקל כפול spacer (זמינים מסחרית, ראה טבלה של ריאגנטים ספציפיים וציוד להלן).
3. המקום, סרט דביק בצד למטה, במגע עם פני השטח של השקופית.
4. לחץ חותם את הסרט לשקופית באמצעות ברייר או רולר. רדיד אלומיניום ניתן להציב בין הסרט לבין רולר כדי להגן על הבסיס של בארות.
5. הסר את מכסה נייר שני מהקלטת לחשוף משטח דביק העליון.
6. המקום היחיד coverslips silanized בסמיכות הצלחת לאיטום מהיר ויעיל של בארות בהקדם הטעינה הושלמה.

חלק 2: הכנת מזרק ליפידים

1. מניחים את השומנים (לעתים קרובות monoolein) בבלוק בקרת טמפרטורה ב 45 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות כדי להבהיר את זה מותך.
2. בעוד השומנים הוא נמס להכין שתי 100-μL גז הדוק מזרקים המילטון לשימוש צעד שומנים החלבון ערבוב. הסר את טבעת חזוק טפלון מן המזרק שיכיל את פתרון חלבון. הנח את המזרק כי תקיים את השומנים לצד זה (להשאיר טבעת חזוק שלה במקום).
3. חבר את מצמד (ראו טבלה של ריאגנטים ספציפיים ציוד מתחת והפניה 3 (Cheng et al. 1998)) על המזרק השומנים. אצבע להדק את מצמד על המזרק אך לא להדק יותר מדי. הסר את הבוכנה מלוע של המזרק השומנים.
4. שים לב, שומנים בדם חייב להיות מותך לפני שתמשיך. הגדר את פיפטה כדי μL 30 ולאט לאט תופסים כ -30 μL של השומנים מותכת. לאט לאט לספק כמה שיותר שומנים מותכת כפי שאתה יכול לתוך סוף הפתוח של המזרק נזהרת שלא להציג את הפערים האוויר.
5. מניחים את הבוכנה לתוך החבית במגע עם שומנים מותך לאט לקדם את הבוכנה עד החבית עם המזרק שנערך אנכית כפי שמודגם בסרטון. בועות אוויר העלולות להיות לכוד בשוגג צריך לעלות בתהליך ישוחרר.
6. בזהירות לקבוע את עוצמת הקול של השומנים בתוך המזרק ידי קריאת הסימונים על חבית את המזרק.
7. החלק את ferrule על המחט המשתרעת מצמד. השתמש הבוכנה כדי לאלץ את השומנים מותכת את החבית ואת לאט ובעדינות לתוך המחט בליבה של מצמד.

חלק 3: הכנת מזרק חלבון

1. הפתרון חלבון צריך להיות סובב על g 14,000 במשך 5 עד 10 דקות 4 ° C כדי להסיר אגרגטים גדולים לפני הקמת ניסויים התגבשות. הסר את פתרון חלבון מן הקרח ולאפשר לו לאזן בטמפרטורת החדר.
2. חישוב נפח של תמיסת חלבון להשתמש כדי ליצור את שלב ב מעוקב או קרוב הידרציה מלאה. עבור monoolein ב 20 ° C, לחות מלא עם מים מתרחשת במים קרוב ל -40% (לפי מסה) כמו בתרשים שלב ⁵ (איור 5).
3. עם מזרק 25 או 50 המילטון μL לקחת את העוצמה הנדרשת פתרון חלבון. מעבירים את הפתרון על קצה טפלון של הבוכנה בתוך חבית של המזרק חלבון לטפל כדי למנוע בועות אוויר.
4. לסגת בזהירות את המחט למדוד את עוצמת הקול של פתרון חלבון המזרק. יש להתאים את ערך נמסר בשלב הקודם.
5. לאט לאט אינץ הפתרון חלבון עד החבית בסופו של דבר מיושר עם סוף פתוח.
6. בורג את המזרק לתוך חלבון סוף פתוח של מצמד המצורפת המזרק השומנים. זה קריטי, כי המכשיר לא להדק יתר על המידה. במהלך הידוק המכשיר ערבוב התאספו בשלב זה יפגע מתנוצץ בחישוקי המתכת שלהם ולגרום דולף. במסגרת הידוק תביא גם דולף.

חלק 4: חלבון פתרון ליפידים ערבוב: ביצוע Mesophase

1. כדי השפעה ערבוב, לקדם את הבוכנה בצד חלבון יחידת ערבוב התאספו כדי להגביל את שלה, עם האגודל או האצבע המורה נהיגה הפתרון חלבון מן המזרק חלבון, באמצעות מצמד לתוך המזרק השומנים.
2. הבוכנה בצד השומנים משמש כיום לנהוג את תוכן המזרק השומנים בחזרה דרך מצמד לתוך המזרק חלבון.
3. התהליך חוזר על עצמו פעמים רבות, מדי פעם, מאה קטעים או יותר נדרשים כדי לייצר mesophase הומוגנית. בתחילת ערבוב, התנועה של החומר הלוך ושוב דרך מצמד יכול להיות אחיד, ולעתים, כוח נוסף נחוץ כדי ערבוב השפעה. ערבוב ראשוני בדרך כלל מלווה בהתפתחות לא אחידה עכירות במדגם. כפי homogenization מתקדמת, המרקם הופך אחיד יותר מאפיין של השלב מעוקב צמיגה, כמו גם המראה החזותי של mesophase מעוקב המתעוררים.
4. אם התנאים מתאימים, ועל הדרכים שלב מעוקב, פיזור אמור להופיע שקוף אופטית בתוך חבית את המזרק. לכן, הסימונים על חבית את המזרק צריך להיות ברור וקריא דרך mesophase בחבית.
5. התקררות קלה מאוד של המדגם במהלך ערבוב ידי הנחת מערבל מזרק לזמן קצר על הקרח יכול להאיץ homogenization והשגת שקיפות. עם זאת, חשוב לא overcool המדגם.
6. יש להקפיד כדי למנוע ערבוב נמרץ מאוד, כמו זה יכול לגרום לעליית הטמפרטורה מדגם עקב חימום חיכוך ^3.

חלק 5: טעינת Dispenser

1. הסר את המחט על הבוכנה של מזרק המילטון 10-μL. השאירו את טבעת חזוק טפלון במקום.
2. הסר את אגוז שמירה ממתקן בעזרת מטבע קטן.
3. עם הזרוע מחגר נסוגה באופן מלא, הכנס את המזרק - ללא הבוכנה שלה מחט - דרך טבעת החזקת מנפק.
4. החלף את אגוז תומכים, מול הצד אטם את המזרק, ואת בורג אותו בחוזקה על הקצה הפתוח של המזרק.
   יש להקפיד על מנת להבטיח את המזרק מרוכז כראוי בזירה מחזיק וכי חבית מיושר במקביל הזרוע מחגר. שניהם יכולים להישפט על ידי העין. שתי דרישות אלה הן קריטיות כדי למנוע דליפה.
5. לעבור את הבוכנה דרך הטבעת מרתק עם אגוז תפסן פתחה כמה פניות ולכוון את הבוכנה לתוך סוף הפתוח של המזרק. לדכא את הזרוע מחגר מלא. הזז את הבוכנה לתוך החבית ולבדוק כי הוא נוסע באופן חופשי ואמיתי בחבית. זה עשוי לעזור לשחרר את הבורג על הבר מדריך כדי להקל על הבוכנה לנוע בחופשיות. ודא כי היא עושה. לוחץ על המתג עד קצה טפלון שלה מתיישר עם סימן הסיום האפס μL על החבית. אם את הבורג על הבר מדריך התרופף, retighten אותו ולבדוק כי הבוכנה נעה בחופשיות.
6. הזז את הבוכנה בצד אחד של יחידת ערבוב התאספו לציון סיום האפס μL להעביר את mesophase אל המזרק השני ואת מצמד.
7. נתק את המזרק ריקה (עם טבעת חזוק שלה במקום) מיחידת ערבוב מיד לחבר את המזרק טעון - עם מצמדttached - הפסקת הליכי המזרק מחלק 10-μL. מידת אטימות שבה נעשה צימוד הוא קריטי, כפי שכבר צוין.
8. טען את המזרק מחלק מדכא את הבוכנה של המזרק 100-μL כך ההעברות mesophase באמצעות מצמד.
9. Secure קצר, שקצהו שטוח מחט סיום הפלדה של המזרק מחלק ובזהירות להדק אותו במקומו.
10. קלאמפ על הבוכנה לזרוע מחגר על ידי הידוק אגוז בזירה מרתק. יש להקפיד לא מעל להדק את האום, כמו זה יכול לעוות את הניקוד ואת הבוכנה טיוח זה לא שמיש. חשוב כי טווח הנסיעה סיפק לזרוע מחגר במצב הידק להיות מוגבל ללא יותר סנטימטר, כפי שמודגם בסרטון. מעבר לכך, הבוכנה תהיה נטייה אבזם ואספקה ​​יכול להיכשל.
11. לדכא את תוף מחגר מספר פעמים כדי לקדם את הבוכנה בחבית, ובכך ממלאת את נפח החלל של המחט וטעינה את המחט. שלב זה יש לחזור (עד עשר פעמים), עד מחרוזת רציפה של mesophase מגיח מקצה המחט.
12. ניסויים התגבשות צריכה להתחיל מיד, כמו חלבונים מסוימים אינם יציבים בשלב מעוקב ללא נמהר הוסיף.

חלק 6: הגדרת צלחות התגבשות

1. מניחים צלחת רב גם התגבשות ו coverslip על משטח מוגבה כמה סנטימטרים מעל הספסל לעבוד על מנת להקל על הטעינה. בניגוד אופטימלית והראות משופרת מושגות כאשר פני השטח חשוך מעט.
2. Homogenize הפתרונות נמהר ואת מסירה את הפקק מעל צלוחיות. הגדר את pipet נמהר מחלק את μL 1.
3. עם המזרק במאונך מחלק שנערך ביד אחת, יד חופשית להשתמש כדי למקם את קצה המחט במרכז ישירות מעל בסיס מספר 1 היטב. לחצו על הלחצן על מנפק החוזר לגרש בולוס של mesophase על משטח הזכוכית. נפח בולוס הוא 200 NL כאשר מנפק לחזור הסטנדרטי הוא משמש עם מזרק 10-μL. קצה המחט צריכה להיות לא יותר מאשר כמה מאות מיקרומטרים מעל בסיס טוב כדי להבטיח אספקה ​​נאותה.
4. לאחר 4 בארות הסמוך נטענים עם mesophase, מקום 1 μL של פתרון נמהר על גבי בולוס כל mesophase באמצעות pipet 2-μL וטיפים הפנויה הסטנדרטית.
5. מהר ככל האפשר, למקום coverslip ישירות על בארות מלא כדי לכסות אותם באופן אחיד. כדי השפעה חותמת מים חזק, להשתמש במרית להפעיל לחצים coverslip שבו הוא בא במגע עם המשטח דביק חשוף של הקלטת spacer.
6. Mesophase ו מזרז תהליך מחלק ניתן לחזור עד שכל בארות בצלחת נטענים וחתום.
7. לייבל את הצלחת בבירור למטרות מעקב. רגישים לאור חלבונים מטופלות בדרך כלל על ידי לפפה צלחות בנייר אלומיניום לפני הצבתם בחדר הדגירה.
8. מקמי את הצלחות בחדר בקרת טמפרטורה, בדרך כלל בשעה 20 ° C.
9. לפי לוח זמנים קבוע, לבדוק את בארות לצמיחה קריסטל באמצעות מיקרוסקופ אור מקוטב עם יעד של 10 או פי 20. לוח הזמנים בשימוש במעבדה של המחבר הוא כדלקמן: היום 0, 1, 2, 3, 5, 7, 14, 21, 30 ו - 60 שלאחר ההתקנה. בזהירות לבדוק את בולוס mesophase התאמת עומק המיקוד בתוך המדגם 0.14 מ"מ בעובי. הבדיקה צריכה להיעשות הן אור רגיל בין חצה-מקטבים.

חלק 7: תוצאות נציג

הופעתו של גבישים וכתוצאה מכך ישתנו עם צבע הטבועה של חלבון קרומי הקיטוב של האור המשמש לבדיקה (או היעדרה) ואת השיטה ואת איכות התאורה. איור 6 מציג מספר הופעות גביש אפשרי. חלבונים בממברנה בצבע טבעי הגדל טווינה כאשר הוא מוצג באור רגיל יכול להיראות כמו אלה שמוצג באיור 6 (לוחות ב 'ו ד). חסר צבע חלבון קרום גבישים גדל בשלב מעוקב כאשר צפו באור רגיל יכול להיראות כמו אלה שמוצג באיור 6 (לוח ה). לבסוף, חסר צבע חלבון קרום גבישים הגדלים טווינה כאשר צפו עם אור מקוטב יכול להיראות כמו איור 6 (לוחות ג).

השלבים הבאים בתהליך הכולל של קביעת מבנה הן הקציר cryo-לקרר את קריסטלים להקליט ולנתח רנטגן עקיפה מהם. נושאים אלה להיות מכוסה במאמרים יופיטר נפרד.

באיור 1. ייצוג סכמטי של קרום ביולוגי המראה את bilayer השומנים ועל אשר נמצאים מגוון של חלבונים.

איור 2. מבנהשל ויטמין B ₁₂ BtuB הובלת חלבון, לפתור באמצעות מושלם וקריסטלים גדל על ידי שיטת טווינה ⁶ מאויר במאמר זה יופיטר.

איור 3. מחזור מבנה פונקציה ממחיש רבים של השלבים הכרוכים בהשגת מידע ושימוש מבנית מלאה על חלבון.

איור 4. תרשים זרימה מסכם את הצעדים מעורבים בייצור של גבישי חלבון הממברנה על ידי שיטת טווינה. רק צעדים אלו מוקפים בקו אדום מקווקו מכוסים במאמר זה יופיטר. מתוך עיון 2.

איור 5. פשוטה טמפרטורה הרכב דיאגרמת פאזות עבור שומנים בדם (monoolein) / מערכת המים. ניסויים התגבשות מוגדרים על 20 ° C היכן השומנים מרווה עם מים 40% לחות. התרשים שלב מפורט זמין הפניה 5.

איור 6. גבישים של חלבונים בממברנה הגוברת mesophase lipidic.
(א) ויטמין B ₁₂ חלבון הובלה, BtuB ^6, (ב) לאור מורכבות קצירת II ^7, (ג) adhesin / invasin OpcA ^8, (ד) bacteriorhodopsin ^9, (ה) טרנספורטר פחמימות מ Pseudomonas. תמונות מוקלטות עם אור רגיל (ב, ד, ה) ובין מקטבים חצה (א, ג).

Discussion

השלב מעוקב היא סביבה עדין דינמי שיכול להשתנות עם שינוי דרסטי של מספר משתנים. אי אפשר לתת תיאור של תוכנית ההתקנה של ניסויים טווינה התגבשות במצב ידני המתאר את כל בעיות פוטנציאליות. עם זאת, קשיים רבים ניתן להימנע על ידי תרגול הטכניקה לפני החלת אותו חלבון פתרונות יקרים באמצעות התמתנות הלחץ המופעל על מזרקים במהלך ערבוב. בוצע כהלכה, שיטת טווינה יכולה להניב גבישים של מגוון רחב של חלבונים, מספר המהווה בהתמדה.

התיאור שניתן כאן ההתקנה של ניסויים טווינה התגבשות מתמקדת במצב הידני. התהליך יכול להיות, ולעתים קרובות הוא שונה כדי להקל על ההתקנה האוטומטי של צלחות התגבשות באותם מקרים הדורשים בקנה מידה גדול הקרנה של התגבשות התנאים.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Protein solution	Reagent	Various	Various
Lipid (monoolein)	Reagent	Sigma-Aldrich	Various
Precipitant solutions	Reagent	Various	Various
Purified water	Reagent	EMD Millipore
Pipetting devices	Tool	Pipetman	Various
Disposable pipet tips	Disposable	Pipetman	Various
Gas-tight syringes	Tool	Hamilton Co	80265 (25-µl)
Syringe tips	Tool	Hamilton Co	7770-020 (gauge 22)
Narrow bore coupler*	Tool	Hamilton Co	various/EBS-LCP-2
Repeating dispenser	Tool	Hamilton Co	83700
Silanized glass microscope slides	Disposable	Gold Seal	3010
microscope coverslips	Disposable	Fisher Scientific	12-548C
Perforated double-stick spacer tape	Disposable	Saunders Corporation (hole-punched)	NA
Tweezers	Tool	Various	NA
Brayer (roller)	Tool	Fisher Scientific	50820937
Chipped ice	Temperature Control	N/A	NA
Tissues	Disposable	N/A	NA
Calculator	Tool	Various	NA
Lab notebook	Tool	Various	NA
* Full details for machining your own Narrow Bore Coupler are provided in Reference 3.