Summary
Burada lipidik mesophases membran proteinlerinin kristalizasyon denemeleri elle kurmak için Caffrey Membran Yapısal ve Fonksiyonel Biyoloji Grubu uygulanan prosedür açıklanmıştır.
Abstract
Lipidik mesophases kullanarak zarı proteinleri kristalize için ayrıntılı bir protokol açıklanmıştır. Bu yöntem çeşitli lipidik kübik faz olarak veya mezo yöntem anılır olmuştur. Yöntemi prokaryotik ve ökaryotik proteinlerin X-ışını kristal yapıları, monomerik, homo ve hetero-multimer kromofor içeren ve kromofor proteinlerin çözmek için kullanılan edildiğini oldukça çok yönlü ve alfa oldu sarmal ve beta-barrel proteinler. Mezo kristalizasyon kullanarak son başarıları insan mühendisliği beta2-adrenerjik ve adenozin A2A G-protein reseptörler. Protokoller monoolein tabanlı mesophase içine membran proteini yeniden ve manuel modda crystallizations kurmak için sunulmaktadır. Genel süreci, kristal hasat gibi ek adımlar, gelecek video makalelerde ele alınacak. Protein yüklü mesophase hazırlamak ve bir kristalizasyon plaka kurmak için gerekli süre yaklaşık bir saat manuel.
Protocol
Yapısal ve işlevsel biyoloji alanında önemli bir odak, biyolojik membran (Şekil 1). Hücre ve alt hücresel organelleri çevreleyen zar, sadece iki lipit molekülleri arasında moleküler ince bir yapıya ve protein ile çivili. Lipid ve proteinlerin yapısı ve fonksiyonu ilgi çekicidir. Ancak, bu makalenin odak zarı proteinleri ile sınırlıdır.
Membran proteinlerinin moleküler düzeyde nasıl işlediğini daha iyi bir anlayış, iki nedenden dolayı aranır. Öncelikle, bunların nasıl çalıştığını bilmek, entelektüel tatmin vardır. İkincisi, bir proteinin nasıl çalıştığını bilerek, özel uygulamalar için onu değiştirmeye bile arıza olması gerektiği veya iyileştirilmesi veya düzeltmek mümkün olma ihtimali her zaman vardır. İlaç tasarımı, iş bu tip bariz bir sonucudur. Bir yaklaşım, bir membran proteini moleküler düzeyde nasıl çalıştığını endam yapısını belirlemek için. Bu protein oluşturan bütün atomların 3-boyutlu uzayda yer, ya da en azından olmayan tüm hidrojen atomları, kuran içerir. Bu amaç için kullanılan yöntem makromoleküler X-ışını kristalografisi (MX). Şekil 2 yapısı tam kullanarak belirlenen bir membran proteini bir örnek gösterir. Protein bir kırınım kaliteli kristal MX yapmak gereklidir.
Açıkçası, makromoleküler kristalografisi kullanarak yapı belirlenmesi dahil pek çok adım vardır. Bu Şekil 3'te gösterilmiştir. Tipik olarak, bu bir membran proteini hedef belirleme ve daha sonra, üreten, arındırıcı ve kristalize. Bir ev veya bir sinkrotron X-ray kaynağını kullanarak kristal Kırınım ölçümleri yapılmaktadır. Kırınım verileri sonra moleküler bir modeli ile donatılmış bir elektron yoğunluk haritası verimli işlenir. Bu model, rafine edilmiş, proteinin etki mekanizması keşfetmek için kullanılan ve yapı-bazlı ilaç tasarımı için olabilir
Bu makalenin odak noktası, mezo yöntem denilen zarı proteinleri lipidik mesophases kullanarak kırınımı kaliteli kristal üretmeye nasıl göstermektir. Referans 1 (Caffrey 2009) yeni bir değerlendirme yöntemi ve kapsamı kullanılabilir. Referans 2 (Caffrey ve Cherezov, 2009) biz burada takip edecek adım-adım protokolü açıklanmıştır.
Bir mezo membran protein kristalizasyon deneme kurmak için gerekli olan ve zaman alan adımları özetleyen bir akış şeması Şekil 4'te gösterilmiştir . Bu makale, kesik kırmızı çizgiler ile kapalı bu adımları kapsar.
Bölüm 1: Kristalizasyon Tabaklar hazırlanması
- Çalışma tezgahı üzerinde Silanlanmış mikroskop lamı yerleştirin.
- Delikli çift sopa ayırıcı bant şerit (piyasada Belirli Reaktifler ve aşağıda Ekipman Tablo) bir yüzey koruyucu kağıt kapağını çıkarın.
- Slayt yüzeyi ile temas halinde, bant, yapışkan tarafı aşağı yerleştirin.
- Basınç mühür brayer veya rulo kullanarak slayt bant. Alüminyum folyo bant ve kuyuların tabanını korumak için silindir arasına yerleştirilir.
- , Üst yapışkan yüzey için bant ikinci kağıt kapağını çıkarın.
- En kısa sürede yükleme gibi hızlı ve etkin bir sızdırmazlık için kuyu plaka yakın yerleştirin bireysel Silanlanmış lamelleri tamamlandı.
Bölüm 2: hazırlanması Lipid Şırınga
- , 45 ° C, 3 dakika boyunca erimiş hale sıcaklık kontrollü bir blok lipid (genellikle monoolein) yerleştirin.
- Lipid erime olsa da, lipid-protein karıştırma adım kullanım için iki adet 100 mcL gaz sızdırmaz Hamilton şırınga hazırlar. Teflon halkalı protein solüsyonu içeren şırınga çıkarın. (Yerine halkalı bırakarak) yanında lipid yapacak şırınga yerleştirin.
- Coupler lipid şırınga (bkz: Belirli Reaktifler ve Ekipman aşağıda ve Referans 3 (Cheng ve ark Tablo, 1998)) bağlayın . Şırıngaya coupler parmağınızla sıkıştırın ama aşırı sıkmayın. Namlu lipid şırınga pistonu çıkarın.
- Lipid devam etmeden önce erimiş olması gerektiğini unutmayın. 30 mcL pipet ve yavaş yavaş erimiş lipid yaklaşık 30 mcL kadar sürebilir. Yavaş yavaş hava boşlukları tanıtmak için özen şırınga gibi açık ucunu erimiş lipid kadar teslim.
- Erimiş lipid ile temas pistonu namlu içine yerleştirin ve yavaş yavaş şırınga ile dikey olarak video gösterilmiştir düzenlenen varil kadar piston önceden. Yanlışlıkla kıstırılmış olabilir hava kabarcıkları süreç içinde yükselişi ve mahkemece serbest bırakıldı.
- Dikkatlice okuyarak şırınga varil üzerinde işaretler şırınga lipid hacmi belirlemek.
- Slayt demirliKuplörün uzanan iğne üzerine Áizelgesine. Varil kadar yavaş ve nazikçe Kuplörün çekirdek iğne içine erimiş lipid zorlamak için piston kullanın.
Bölüm 3: Protein Şırınga hazırlanması
- , 4, 5 ila 10 dakika boyunca 14.000 g protein çözümü eğrilecektir ° C kristalizasyon çalışmalarda kurmadan önce büyük agrega kaldırmak için. Buz protein çözüm çıkarın ve oda sıcaklığına gelmesini sağlayınız.
- Kübik fazda ya da tam hidrasyon yakın kullanmak için protein solüsyonu hacmi hesaplayın. Monoolein 20 ° C, su dolu hidrasyon faz diyagramı 5 (Şekil 5) olarak% 40'ının su (kütle) oluşur.
- 25 veya 50 mcL Hamilton şırınga ile protein çözüm gerekli olan hacim kadar sürebilir. Teflon piston hava kabarcıklarını önlemek için özen protein şırınga namlu ucuna çözüm aktarın.
- Dikkatlice, iğne çekilme ve şırınga protein çözüm hacmini ölçmek. Önceki adımda teslim değeri ile eşleşmesi gerekir.
- Yavaş yavaş, açık ucu ile aynı hizada sonuna kadar varil kadar protein çözüm inç.
- Lipid şırıngaya bağlı kuplör açık ucunu protein şırınga vidalayın. Bu cihaz çok fazla sıkmayın bu kritik önem taşımaktadır. Over-bu aşamada monte karıştırma cihazı sıkma ferülü zarar ve sızıntı neden olacak. Under-sıkma da sızıntı için yol açacaktır.
Bölüm 4: Karıştırma Protein Çözüm ve Lipid: Mesophase
- Karıştırma etkisi coupler üzerinden ve lipid şırıngaya, protein şırınga protein çözüm sürüş başparmak ve işaret parmağı ile, protein tarafında monte karıştırma ünitesi sınırına piston önceden.
- Lipid tarafında piston Kuplörün ve protein şırıngaya geri lipid şırınga içeriğini sürücü kullanılır.
- Işlem birçok kez tekrarlanır; bazen, bir yüz geçişleri ya da daha homojen bir mesophase üretmek için gerekli. Karıştırma, Kuplörün malzeme üzerinden ileri ve geri hareketi zaman zaman düzensiz olması ve başında, ekstra güç karıştırma etkisi ihtiyaç vardır. İlk karıştırma genellikle örnek tekdüze olmayan bir bulanıklık gelişimi eşlik eder. Homojenizasyon ilerledikçe yükselen kübik mesophase görünümünü olduğu gibi, doku, daha düzgün ve viskoz kübik fazda karakteristik hale gelir.
- Eğer koşullar uygun ve kübik aşamasını oluşturan, dispersiyon optik şeffaf şırınga varil görünmelidir. Böylece, şırınga varil üzerinde işaretler namlu mesophase ile okunaklı olmalıdır.
- Karıştırma sırasında numune, kısa bir süre için buz üzerinde şırınga mikseri koyarak soğutma homojenizasyon Çok hafif ve şeffaflık başarı hızlandırabilir. Ancak, örnek overcool için önemlidir.
- Bu örnek sıcaklığı, sürtünme ile ısınma 3 nedeniyle yükselmeye neden olabilir Bakım, karıştırma son derece dinç önlemek için önlem alınmalıdır .
Bölüm 5: Dispenser Yükleniyor
- 10 mcL Hamilton şırınga, iğne ve şırınga çıkarın. Teflon halkalı bir yerde bırakın.
- Küçük bir madeni para yardımı ile dağıtıcı tespit somunu çıkarın.
- Cırcır kolu tamamen çekilmiş, şırınga takın, piston ve iğne olmadan dağıtıcı holding halka yoluyla.
- Istinat somun, conta yan bakan şırınga değiştirin ve şırınga açık ucunu sıkıca vidalayın.
Bakım şırınga düzgün tutan halka ve namlu cırcır kolu paralel hizalanmış merkezli sağlamak için alınmalıdır. Her iki göz tarafından değerlendirilecek. Bu iki gereksinimleri kaçağı önlemek için kritik öneme sahiptir. - Tutucu somun, bir kaç döner vida ile sürükleyici bir halka ile piston Pass ve açık ucunu şırınga pistonu kılavuzu. Cırcır kolu tamamen basınız. Namlu içine pistonu hareket ettirin ve namlu özgürce ve doğru yolculuk olduğunu kontrol edin. Serbestçe hareket piston kolaylaştırmak için klavuz vidayı gevşetmek için yardımcı olabilir. Emin olun. Pistonu, teflon ucu varil sıfır mcL mezuniyet işareti ile hizalar kadar basınız. Klavuz vida gevşetti olsaydı, sıkın ve piston serbestçe hareket ettiğini gözden geçirmenizde yarar.
- Diğer şırınga ve Kuplörün mesophase aktarmak için sıfır mcL mezuniyet işareti monte karıştırma ünitesinde bir tarafta pistonu hareket ettirin.
- Karıştırma ünitesi boş bir şırınga (onun yerine halkalı) çıkarın ve hemen yüklenen şırınga bağlamak bir couplerttached - 10 mcL dağıtım şırınga dişli feshine. Kaplin yapıldığı gerginlik derecesi Daha önce de belirtildiği gibi, kritik öneme sahiptir.
- Böylece 100 mcL şırınga Medyumu dağıtım şırınga Yük Kuplörün ile mesophase aktarır.
- Dağıtım şırınga çelik sona ermesinden kısa, düz uçlu bir iğne Güvenli ve dikkatle yerine sıkın.
- Kelepçe sürükleyici halka somunu sıkarak cırcır kolu piston. Bakım kullanılmaz hale getirmekteydi piston puan ve deforme olarak, fındık üzerinden sıkmak için değil alınmalıdır. Kenetli durumda cırcır kolu sağlanan videoda gösterildiği gibi bir inç daha fazla hareket alanı ile sınırlı olması önemlidir. Bunun ötesinde, piston, toka ve teslimi başarısız olabilir bir eğilim var.
- Böylece, iğne boşluğu hacmi doldurma ve namlu, iğne yükleme piston ilerlemek için cırcır davul birkaç kez basınız. Bu adım mesophase sürekli bir dize iğne ucundan çıkıncaya kadar (on kata kadar) tekrar edilmelidir.
- Kristalizasyon çalışmalarda bazı proteinler olmadan kübik eklendi Yağışlı aşamasında kararsız olduğu gibi, hemen başlamalıdır.
Bölüm 6: Kristalizasyon Tabaklar ayarlama
- Bir yüzey üzerine çok iyi kristalizasyon plakası ve kapak yükleme kolaylığı için çalışma tezgahı üzerinde birkaç santim kaldırdı yerleştirin. Yüzey biraz daha karanlık, en iyi kontrast ve geliştirilmiş görünürlük elde edilir.
- Yağışlı çözümler homojenize ve şişeleri şapkasını çıkarmak. 1 mcL Yağışlı dağıtım pipetlemeyin ayarlayın.
- Bir yandan dikey düzenlenen dağıtım şırınga ile, merkezi ve doğrudan kuyusu sayısı 1 baz üzerinde iğne ucu pozisyon için ücretsiz bir elinizi kullanın. Cam yüzeye mesophase bolus sınırdışı yinelenen dağıtıcı düğmesine basın. Bolus hacmi standart yinelenen dağıtıcı 10 mcL şırınga ile kullanıldığında 200 nL. Iğne ucu uygun teslim edilmesini sağlamak için kuyu tabanı üzerinde birkaç yüz mikrometre daha fazla olmalıdır.
- 4 komşu kuyuların mesophase, yeri, 2-mcL pipetlemeyin ve standart tek kullanımlık uçları kullanarak her mesophase bolus üst Yağışlı çözüm 1 mcL yüklendikten sonra.
- Mümkün olduğunca çabuk, düzenli bir şekilde karşılamak için dolu kuyular üzerinde kare lamel yerleştirin. Su geçirmez bir mühür etkisi, ayırıcı bant maruz kalan yapışkan yüzeyi ile temas edinceye lamel baskı uygulamak için bir spatula kullanın.
- Mesophase ve yağışlı dağıtım süreci plaka tüm kuyuları yüklenir ve mühürlü kadar tekrar edilebilir.
- Izleme amacıyla açıkça plaka etiketleyin. Işığa duyarlı protein genellikle kuluçka odasında koymadan önce alüminyum folyo tabak sarma tarafından işlenir.
- 20, genellikle, sıcaklık kontrollü bir odasında tabak koyun ° C
- Polarize Işık Mikroskobu kullanılarak kristal büyüme hedefi ile 20 kat 10 veya kuyulardan düzenli olarak kontrol edin. Yazarın laboratuarda kullanılan takvimi aşağıdaki gibi: gün 0, 1, 2, 3, 5, 7, 14, 21, 30 ve 60 kurulum sonrası. 0.14 mm kalınlığındaki numune içinde odak derinliği ayarlayarak mesophase bolus dikkatlice inceleyin. Sınav, normal ışık ve çapraz-polarize arasında yapılmalıdır.
Bölüm 7: Temsilci Sonuçlar
Kristallerin görünüm membran proteini doğal rengi değişecektir, ışığın polarizasyon denetim (veya bunların yokluğu) ve aydınlatma yöntem ve kalite için kullanılır. Şekil 6, birkaç olası kristal görünümleri gösterir. Şekil 6 (b) ve (d Paneller) 'de gösterildiği gibi, normal ışık ile bakıldığında mezo büyüyen Doğal renkli membran proteinlerinin bakabilirsiniz. Renksiz membran protein kristalleri küp faz normal ışık ile bakıldığında büyüyen Şekil 6 (Panel e) 'de gösterildiği gibi bakabilirsiniz. Son olarak, polarize ışık ile bakıldığında mezo büyüyen renksiz membran protein kristalleri Şekil 6 (a ve c Paneller) gibi görünebilir.
Genel yapısının belirlenmesi sürecinde sonraki adımları hasat ve cryo-cool kristallerinin X-ışını kırınımı ve onlardan kaydetme ve analiz etme. Bu konular ayrı vallahi makaleler ele alınacak.
Şekil 1 ve çift katlı lipid gösteren bir biyolojik membran şematik proteinlerin çeşitli bulunmaktadır.
Şekil 2 yapısıvitamin B 12 taşıma protein, BtuB MX ve bu vallahi makalede resimli mezo yöntemi 6 büyüdü kristalleri kullanılarak çözülmüştür.
Şekil 3 yapı-işlev döngüsü hakkında tam bir protein yapısal bilgiler kullanılarak elde edilmesi ve ilgili adımları birçok göstermektedir.
Şekil 4 akış şeması mezo yöntemi membran protein kristallerinin üretiminde yer alan adımları özetlemektedir. Kesikli kırmızı çizgi ile çevrili bu adımları, bu jove makalede kaplıdır. Referans 2.
Şekil 5 lipid (monoolein) / su sistemi için basitleştirilmiş bir sıcaklık-bileşim faz diyagramı. Kristalizasyon çalışmalarda 20 ° C lipid,% 40 hidrasyon su ile doyurur. Referans 5 ayrıntılı faz diyagramı kullanılabilir.
Şekil 6 lipidik mesophase büyüyen membran proteinlerinin Kristaller.
(A), vitamin B 12 taşıma protein, BtuB 6, (b) Pseudomonas ışık hasat, II 7 karmaşık (c) adhesin / invasin OPCA 8, (d) bacteriorhodopsin 9, (e) karbonhidrat taşıyıcı. Görüntüler normal ışık (b, d, e) ve (a, c) arasındaki çapraz polarize kaydetti.
Discussion
Kübik faz hassas ve dinamik bir ortamda bir dizi değişkenin değişmesi ile birlikte önemli ölçüde değiştirebilir. Mezo kristalizasyon çalışmalarda tüm potansiyel tuzaklar açıklayan manuel modda kurulum bir tanımını vermek mümkün değildir. Ancak, pek çok zorlukla pahalı protein çözümlere başvurmadan önce tekniği uygulayarak ve ılımlılık, karıştırma sırasında şırınga uygulanan basınç kullanarak önlenebilir. Doğru yapıldığında, mezo yöntemi proteinlerin geniş bir yelpazede kristalleri verebilmesidir sayısı sürekli artmaktadır.
Mezo kristalizasyon çalışmalarda kurulumu Burada verilen açıklama, manuel mod üzerinde odaklanmıştır . Bir süreç olabilir, ve genellikle, kristalizasyon koşullarını geniş çaplı tarama gerektiren durumlarda kristalleşme plakaları otomatik kurulum kolaylaştırmak için değiştirilmiş.
Acknowledgments
Bu çalışmaya katkıda bulunan pek çok ve en Yapısal ve Fonksiyonel Biyoloji Grubu Caffrey Membran, geçmişteki ve şimdiki üyeleri hem. Tüm bizim en içten teşekkürlerimizi ve takdir uzanır. Bu çalışma Bilim Vakfı İrlanda (07/IN.1/B1836), Sağlık (GM75915) Ulusal Sağlık Enstitüleri ve Limerick Üniversitesi hibe kısmen desteklenmiştir.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Protein solution | Reagent | Various | Various | |
| Lipid (monoolein) | Reagent | Sigma-Aldrich | Various | |
| Precipitant solutions | Reagent | Various | Various | |
| Purified water | Reagent | EMD Millipore | ||
| Pipetting devices | Tool | Pipetman | Various | |
| Disposable pipet tips | Disposable | Pipetman | Various | |
| Gas-tight syringes | Tool | Hamilton Co | 80265 (25-µl) | |
| Syringe tips | Tool | Hamilton Co | 7770-020 (gauge 22) | |
| Narrow bore coupler* | Tool | Hamilton Co | various/EBS-LCP-2 | |
| Repeating dispenser | Tool | Hamilton Co | 83700 | |
| Silanized glass microscope slides | Disposable | Gold Seal | 3010 | |
| microscope coverslips | Disposable | Fisher Scientific | 12-548C | |
| Perforated double-stick spacer tape | Disposable | Saunders Corporation (hole-punched) | NA | |
| Tweezers | Tool | Various | NA | |
| Brayer (roller) | Tool | Fisher Scientific | 50820937 | |
| Chipped ice | Temperature Control | N/A | NA | |
| Tissues | Disposable | N/A | NA | |
| Calculator | Tool | Various | NA | |
| Lab notebook | Tool | Various | NA | |
* Full details for machining your own Narrow Bore Coupler are provided in Reference 3. |
||||
References
- Caffrey, M. Crystallizing membrane proteins for structure determination. Use of lipidic mesophases. Annu. Rev. Biophys. 38, 29-51 (2009).
- Caffrey, M., Cherezov, V. Crystallising membrane proteins in lipidic mesophases. Nat. Protoc. 4, 706-731 (2009).
- Cheng, A., Hummel, B., Qiu, H., Caffrey, M. A simple mechanical mixer for small viscous lipid-containing samples. Chem. Phys. Lipids. 95, 11-21 (1998).
- Cherezov, V., Caffrey, M. Nano-volume plates with excellent optical properties for fast, inexpensive crystallization screening of membrane proteins. J. Appl. Cryst. 36, 1372-1377 (2003).
- Qiu, H., Caffrey, M. The phase diagram of the monoolein/water system: metastability and equilibrium aspects. Biomaterials. 21, 223-234 (2000).
- Cherezov, V. In meso structure of the cobalamin transporter, BtuB, at 1.95 A resolution. J. Mol. Biol. 364, 716-734 (2006).
- Cherezov, V., Clogston, J., Papiz, M. Z., Caffrey, M. Room to move: crystallizing membrane proteins in swollen lipidic mesophases. J. Mol. Biol. 357, 1605-1618 (2006).
- Cherezov, V. In meso crystal structure and docking simulations suggest an alternative proteoglycan binding site in the OpcA outer membrane adhesin. Proteins. 71, 24-34 (2008).
- Cherezov, V., Peddi, A., Muthusubramaniam, L., Zheng, Y. F., Caffrey, M. A robotic system for crystallizing membrane and soluble proteins in lipidic mesophases. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 60, 1795-1807 (2004).
