Summary
Respostas eletrofisiológicas de neurônios sensoriais olfativos de odores pode ser medido em insetos usando gravações sensillum único. Neste artigo vamos demonstrar de vídeo como realizar gravações sensillum única nas antenas da mosca do vinagre (
Abstract
O sentido do olfato é essencial para insetos para encontrar alimentos, companheiros, predadores, e os locais de oviposição 3. Inseto neurônios sensoriais olfativos (ORS) são colocados em pêlos sensoriais chamados sensilla, que cobrem a superfície dos órgãos olfativos. A superfície de cada sensillum é coberta com minúsculos poros, através do qual odorants passar e dissolver em um líquido chamado linfa sensillum, que banha os dendritos sensorial do ORS alojados em um sensillum dado. Os dendritos OSN expressar odorant receptor (OR) proteínas, que em insetos funcionam como canais iónicos dependentes de odor 4, 5. A interação de odores com ORs aumenta ou diminui a taxa de disparo basal da OSN. Esta atividade neuronal na forma de potenciais de ação incorpora a primeira representação da qualidade, intensidade e características temporais do odorant 6, 7.
Dado o fácil acesso a estes pêlos sensoriais, é possível realizar gravações extracelular de ORS único pela introdução de um eletrodo de registro para a linfa sensillum, enquanto o eletrodo de referência é colocado na linfa dos olhos ou do corpo do inseto. Em Drosophila, sensilla casa entre uma e quatro ORS, mas cada OSN normalmente exibe uma amplitude pico característico. Técnicas de classificação de Spike torná-lo possível atribuir respostas spiking a ORS individual. Este single sensillum técnica de gravação (SSR) monitora a diferença de potencial entre a linfa sensillum eo eletrodo de referência como os pontos elétricos que são gerados pela atividade do receptor de ORS 1, 2, 8. Mudanças no número de espigas, em resposta ao odor representam a base celular do odor de codificação em insetos. Aqui, descrevemos o método de preparação usado atualmente em nosso laboratório para realizar SSR em Drosophila melanogaster e Anopheles gambiae, e mostrar os traços representante induzida pela odores de forma sensillum específicos.
Protocol
1. Diluições odor
- A maioria dos odores são solúveis em óleo de parafina. No entanto, DMSO ou etanol também pode ser usado como solventes alternativos para odores particular. Preparar diluições apropriadas (por exemplo, volume de 1:10: volume; v: v) de odores pura em frascos de vidro. Diluições mais odor são estáveis à temperatura ambiente, mas para compostos altamente voláteis, é melhor fazer diluições trabalhando em uma base semanal. Cada sensillum responde aos odores diferentes dentro de uma faixa de concentração diferente. Para Drosophila, uma tabela look-up útil para concentrações adequadas para uso com um sensillum dado pode ser encontrada em 6 de 7.
Para o experimento de vídeo, usamos óleo de parafina como um controle de solvente e acetato de metila (10 -6 v: v em óleo de parafina) e 1-octen-3-ol (10 -7 v: v em óleo de parafina) para Drosophila e Anopheles gravações, respectivamente. - Com uma tesoura, corte o papel para cromatografia em 3 mm x 5 tiras centímetros para que eles se encaixam dentro de pipetas Pasteur.
- Pipetar 30 mL do odor desejado sobre uma tira de papel filtro e insira-o na pipeta de vidro. Cut ~ 3 cm de ar tubo de linha e insira-o na extremidade aberta da pipeta, fechando-a com um conector. O conector é usado para selar a pipeta que será então anexado ao tubo de ar da linha de uma bomba de ar, quando é hora de entregar o odor durante o experimento.
2. Sistema de entrega de odor
- Usando uma broca pequena, corte a 10 mL de plástico sorológicos pipeta (por exemplo, no 4 mL marca) e criar dois buracos (por exemplo, no mL -1,5 e -0,5 marcas mL) que será usada para manter as pipetas contendo os odores. Inserir uma ponteira 200 mL no acoplador farpado e introduzir o acoplador na extremidade sem corte da pipeta 10 mL. A pipeta será usado como parte do sistema de entrega de odorantes.
- Anexar a pipeta em um suporte magnético com um grampo de pipeta e posicioná-lo perto do microscópio.
3. Eletrodos nitidez
- Para aguçar eletrodos, preparar uma solução 0,5 M de hidróxido de potássio (KOH) e filtro para remover partículas finas (por exemplo, usando um filtro de M 45). Pegue uma seringa de 20 ml e faça um pequeno furo (~ 2 mm de diâmetro) utilizando uma agulha na parede perto do (~ 1 cm da ponta), em que o fio elétrico está inserido (Figura 1A). Ponta
- Encha a seringa com 0,5 M KOH, e apertá-lo em um suporte sob o microscópio para que a ponta é colocada no campo de visão (Figura 1B, C). Insira o fio elétrico no pequeno orifício na parede da seringa (Figura 1B), certificando-se que o fio não está diretamente na frente da entrada da seringa. Ligue este fio para o catodo de uma fonte de alimentação DC (por exemplo, Heerbrugg Selvagem MTR32, ver métodos) ou um pólo de uma fonte de alimentação AC (por exemplo Selvagem Heerbrugg-LEP 990.018). Anexar o eixo suporte do eletrodo para o micromanipulador manual sobre o lado direito do microscópio, e anexar um cabo elétrico na base do eixo do suporte do eletrodo com um clipe de crocodilo. Conecte o cabo para o ânodo da fonte de alimentação DC ou o outro pólo da fonte de alimentação AC (Figura 1A).
- Insira o fio de tungstênio (~ 5 cm de comprimento) para o suporte do eletrodo, e anexá-lo ao eixo do suporte do eletrodo sobre o manipulador. Definir a fonte de alimentação 6 V, e insira a ponta do fio dentro da seringa várias vezes para aprimorar-lo, tomando cuidado para monitorar a ponta sob o microscópio durante o processo (Figura 1C). Para obter um eletrodo ideal para a gravação, coloque 90% de seu comprimento na solução por até 1 min, e retire-o lentamente. Em seguida, insira apenas ~ 50% do eletrodo para mais fina por 30 s, e repita-o para obter a ponta do fio afiado (~ 10 vezes).
A ponta do eletrodo deve ser fino o suficiente para entrar no sensillum, mas não tão fina como a dobrar quando se toca durante as gravações (passos 6 e 7). Embora observando a ponta do eletrodo sob o microscópio de dissecação enquanto ele está sendo afiada é uma boa indicação de sua espessura, apenas olhando para ele sob o microscópio de gravação em alta ampliação dará uma idéia clara se um eletrodo dado é adequado para a gravação.
4. Inseto prep: Drosophila antena
- Construir um aspirador de voar. Corte um pedaço de tubo de ar longa o suficiente para pendurar confortavelmente em seu pescoço (cerca de 90-120 cm). Corte a ponta de uma ponteira 200 mL e inseri-lo em uma das extremidades do tubo. Por outro lado a posição final, a ~ 1,5 cm x 1,5 cm de malha peça para que ele cria uma barreira física, mas não impede o fluxo de ar para fora do tubo. Corte a ponta de uma pipeta de 1 mL e posição do ponta mais larga em cima da abertura do tubo, bloqueando a malha no meio. Esta parte será usada para pegar e manipular moscas do vinagre adultos (Figura 2).
- Dê uma lâmina de microscópio e coloque um pedaço de cera dental mais ou menos no meio do lado longo. Em cima dela positiond tampa de vidro ligeiramente inclinada para cima (~ 30), certificando-se que a cera não está diretamente abaixo da parte mais alta, o que impediria a visualização do vinagre voar sob o microscópio. Puxar um eletrodo de vidro com o puxador vertical. Sua ponta deve ser fina e flexível o suficiente para caber entre o segundo e terceiro segmento antenal, e manter a estabilidade de antena para as gravações. Posição do eletrodo de vidro em um outro pedaço de cera e coloque-o no lado da tampa de vidro, longe o suficiente para que quando a ponta é reduzida atinge o canto da tampa de vidro (Figura 3A).
- Trabalhar a partir de uma garrafa ou frasco de moscas adultas do genótipo desejado, pegar uma mosca vinagre adultos usando o aspirador voar. Embora as fêmeas são normalmente utilizados por causa de seu maior tamanho, os machos também podem ser usados. Coloque uma ponteira 200 mL em cima da ponta de 1 mL para evitar a voar a partir de escapar. Soprar no tubo, de modo que a mosca é empurrado para o final da ponta da pipeta 200 mL. Guarnição da extremidade larga da ponta da pipeta com a lâmina de barbear alguns milímetros de distância do fly-se, em seguida, insira um pouco de cera para evitar a voar a partir de backing out. Sob um microscópio, corte outra vez perto da cabeça da mosca do vinagre, prestando atenção para não danificar o animal. Com uma ponteira de pequeno porte, empurrar a cera para forçar a cabeça voar para fora de modo que cerca de metade dos olhos extrusão da ponta (Figura 3B). Certifique-se que suas pernas não saem tão bem, ou eles podem se mover e interferir com as gravações.
- Monte a voar em um pedaço de cera, a cabeça virada para cima, e coloque-o no slide na frente do vidro da tampa. Empurre a cabeça ligeiramente contra o canto do vidro, de modo que as antenas estender e descansar sobre o vidro. Inferior a ponta do capilar de vidro entre o segundo e terceiro segmento antenal (Figura 3B).
- Diferentes partes da antena dará acesso a tipos diferentes sensilla. Dependendo necessidades específicas experimental, a antena deverá ser orientado de forma diferente para permitir o acesso a tipos diferentes sensilla. Para gravar a partir sensilla basiconic grandes como em nosso exemplo, a arista é empurrado para baixo no vidro (Figura 3B).
5. Inseto prep: Anopheles palpos maxilares
- Usando um aspirador elétrico (Figura 2E), recolher 40-60 3-5 dias de idade mosquitos (machos e fêmeas misturados) na gaiola de plástico pequeno (Figura 2F). Mosquitos deveria ter sido criados em condições normais, ou seja, uma incubadora de insetos ou insetário de 25-28 ° C com umidade de 70-80%. Coloque a gaiola de plástico com os animais no gelo para ~ 15 minutos até que eles são anestesiados pelo frio. Uma vez que os animais têm parado de se mover, a transferência somente 4-6 animais ao palco sob o microscópio de uma só vez, mantendo o resto dos animais no gelo durante os procedimentos. Embora as fêmeas são normalmente utilizados por causa de sua sensibilidade ao CO 2, os homens também podem ser empregadas. Selecione mosquitos feminino ou masculino, a julgar pela estrutura de sua antena (feather-like nas fêmeas, filamento semelhante em homens), e remover as suas asas e pernas com uma pinça fina para imobilizá-los. Mantê-los em um copo de plástico pequeno, com um papel molhado na parte inferior, para impedi-los de dessecação.
- Coloque dois pedaços de fita dupla face (~ 1 cm de comprimento) paralelos uns aos outros (~ 1 cm de distância), no centro e no lado do vidro do carro (Figura 3C). Utilizando uma pinça fina, coloque um mosquito na fita central sob o microscópio de dissecação, e transformá-lo de lado e manter seu corpo e um olho na fita. Ajustar a posição do palpos maxilares para que ambos os palpos estender paralelo na fita (Figura 3D). Palpos maxilares corrigir o colocando cordas finas (por exemplo, cabelos humanos), tanto na base e na ponta de palpos (Figura 3D). A fita lateral é usado como um repositório de cordas finas, enquanto a fita central precisa ser substituído após cada gravação (Figura 3C).
6. Gravação de Drosophila melanogaster
- Coloque o slide sob o microscópio (Figura 4A) com ampliação baixa e posicionar a antena mais ou menos no meio do campo de visão (FOV) (Figura 4B). Delicadamente mais baixo dos eletrodos de modo que o eletrodo de referência está localizado perto do olho da mosca eo eletrodo de gravação é perto da antena (Figura 4C). Aumentar a ampliação e re-posição da antena no meio do FOV (Figura 4D).
- Coloque o odor próximo dispositivo de entrega para a cabeça da mosca, apontando para a antena.
- Com pequeno aumento (Figura 4C), insira o eletrodo de referência para o olho da mosca. Abaixe o eletrodo de registro no topo da antena sem tocar sua superfície.
- Mudar para alta ampliação, controlar o eletrodo de registro com o micromanipulador e inseri-lo em um sensillum selecionados (Figura 4D). Qualquer ponto ao longo do comprimento sensillum é bom para a gravação. Uma vez dentro do sensillum, o eletrodo pode ser empurrado para mais longe na (por vezes durante todo o tempo)para obter uma melhor relação sinal-ruído. Uma vez que o eletrodo está na sensillum, a atividade espontânea das células pode ser detectado.
7. Gravação de Anopheles gambiae
- Coloque a lâmina de vidro sob o microscópio de baixa ampliação (10x) e posicione o palpos maxilares aproximadamente no meio do FOV ea cabeça no topo (Figura 4E). Girar o palco até que um dos palpos é em um ângulo reto com o eletrodo de registro.
- Ajuste a altura dos eletrodos de modo que o eletrodo de referência está posicionada logo acima do olho do mosquito eo eletrodo de gravação está perto do palpos maxilares.
- Coloque o dispositivo de entrega odor de modo que seja o mais próximo possível do palpos.
- Insira o eletrodo de referência para o olho com menor ampliação (10x), e mudar para a maior ampliação (100x), insira o eletrodo de registro no sensillum peg no palpo (Figura 4F). Uma vez que o eletrodo está na sensillum, a atividade espontânea das células pode ser detectado.
8. Resultados representativos
Dependendo do sensillum ea qualidade da gravação, pode-se distinguir diferentes números de neurônios olfativos dentro de um traço único. No sensilla grandes basiconic de Drosophila melanogaster, por exemplo, entre 2 e 4 células que diferem em amplitude pico deve aparecer durante a gravação 9, 10.
Em nosso experimento de vídeo, a Drosophila ab2 sensillum mostra duas células, uma. Uma célula (Figura 5, picos de azul) e uma célula B (Figura 5, os pontos verdes) Nem celular é ativado durante a aplicação de óleo de parafina (Figura 5A), enquanto que somente a célula A responde à diluição 10 -6 de acetato de metila (Figura 5B).
No palpo maxilar do Anopheles gambiae, o ranhuras peg sensillum contém três células, mas apenas dois são facilmente discriminados (Figura 5C, picos de azul e verde, respectivamente). No experimento de vídeo que mostram como as células B responde a uma diluição de 10 -7 1-octen-3-ol (Figura 5D).
Figura 1. Eletrodo sharpener
(A) Vista geral do aparato eletrodo apontador. (B) A seringa contendo 0,5 M KOH (à esquerda) usado para afiar o eletrodo (direita). (C) Close-up da ponta do eletrodo ao lado da abertura da seringa.
Figura 2. Como preparar um aspirador de voar e aspirador de mosquito
(A) A partir do material:... Ar tubo de plástico linha, duas ponteiras de corte, e mesh (B) O aspirador de voar uma vez que está concluída (C) Detalhe da final que é usado para capturar moscas do vinagre Detalhe (D) de a outra extremidade do aspirador voar. (E) O aspirador elétrico para coleta de mosquito consiste de um corpo principal e uma gaiola de plástico destacável. (F) A gaiola de plástico destacável para os mosquitos.
Figura 3. Preparando-se uma mosca do vinagre (Drosophila melanogaster) e um mosquito da malária (Anopheles gambiae) para gravação
(A) Imagem de um vinagre de voar montado no slide antes de posicioná-lo sob o microscópio. (B) Close-up da cabeça voar vinagre com a antena mantido no lugar pelo capilar de vidro. (C) Imagem de um mosquito montado em o slide. (D) Close-up da cabeça de mosquito com tromba e palpos degola na fita.
Figura 4. Gravar a partir de uma mosca do vinagre (Drosophila melanogaster) e um mosquito da malária (Anopheles gambiae)
(A) Vista sobre a configuração de eletrofisiologia. (B) Close-up da preparação voar montado no microscópio. Observe a posição respectiva do eletrodo de registro (à esquerda), o sistema de entrega de odor (meio da pipeta), eo eletrodo de gravação (direita). (C) Imagem da mosca sob a objetiva de 10x. Imagem (D) da antena voar sob 100x o objectivo;. sensilla grande basiconic (setas), intercaladas entre os não-sensoriais cabelos (pontas de seta) vista (E) 10x de um mosquito montado para gravação (F) exibir uma ampliação alta do palpo mosquito e um sensillum peg (seta). .
Figura 5. Exemplos de gravações de Drosophila melanogaster eAnopheles gambiae
(A) A sensillum ab2 de Drosophila melanogaster abriga dois neurônios sensoriais;.. A célula A (pontos azuis) e de células B (spikes verde) (B) As células A e B durante a aplicação de 10 -6 acetato de metila (C) A peg sensillum de Anopheles gambiae abriga dois neurônios sensoriais; a célula A (pontos azuis) e de células B (spikes verde) (D) Aplicação de 10 -7 1-octen-3-ol a sensillum peg..
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Discussion
Pistas olfativas são usados por organismos para identificar fontes de alimento, parceiros em potencial, e predadores. Neurônios sensoriais olfativos (ORS) são o centro primeiro relé entre estímulos externos e os centros superiores do cérebro onde a informação é processada. Em Drosophila melanogaster e Anopheles gambiae, ORS são facilmente acessíveis e sua atividade elétrica pode ser monitorada enquanto estimulado por puffs odor.
A única técnica de gravação sensillum (SSR), explicou neste vídeo tem sido amplamente utilizado para gravar a partir de ORS e estudar as suas respostas elétricas para um grande número de odores 6, 7. O deorphanization de receptores olfativos (OR) 6, 11 eo mapeamento das RUP para locais específicos na antena Drosophila 9, 12, 13 fez a técnica SSR uma ferramenta poderosa para analisar as propriedades eletrofisiológicas das RUP específica in vivo, como um primeiro passo para entender como o mundo externo olfativa é traduzido em sinais elétricos por meio de sua ORS e, finalmente, percebido pelo animal.
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Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraffin oil | Odors | Fluka | 76235 | |
| High purity odors (>98%) | Odors | Sigma-Aldrich | Methyl acetate #296996 1-octen-3-ol #74950 |
|
| Filter paper strips | Odors | Fisher Scientific | 05-714-1 | Chromatography paper |
| Connectors | Odors | Cole-Parmer | EW-06365-40 | 1/16x1/8" |
| Glass vials | Odors | Agilent Technologies | 5182-0556 | |
| Air line plastic tubing | Odor Delivery | Python Products | 500PAL | |
| 1 serological pipette | Odor Delivery | Corning | 4101 | 10 mL |
| Plastic tubing | Odor Delivery | Cole-Parmer | EW-06418-0 | 0.050"x0.090"OD |
| Disposable borosilicate glass Pasteur pipettes | Odor Delivery | Fisher Scientific | 13-678-20A | 5-3/4 inches |
| Programmable stimulus controller | Odor Delivery | Syntech | CS-55 | |
| Anti-vibration table | Electrophysiology Equipment | TMC | 63533 | 36”Wx30”Dx29”H |
| Faraday cage | Electrophysiology Equipment | TMC | MI8133303 | |
| Inverted microscope | Electrophysiology Equipment | Nikon Instruments | E600FN ECLIPSE | Recording microscope |
| 10x and 100x objectives | Electrophysiology Equipment | Nikon Instruments | 10x Plan Fluor 100x L Plan | |
| Dissecting microscope | Electrophysiology Equipment | Nikon Instruments | EZ645 | electrode sharpening/insect prep microscope |
| Magnetic stands | Electrophysiology Equipment | Newport Corp. | MODEL 150 | |
| IDAC | Electrophysiology Equipment | Syntech | IDAC-4 | |
| Acquisition software | Electrophysiology Equipment | Syntech | Autospike | |
| 1 macromanipulator | Electrophysiology Equipment | Narishige International | MN-151 | Joystick manipulator Used for positioning reference electrode |
| 1 micromanipulator | Electrophysiology Equipment | EXFO | PCS-6000 | Used for positioning recording electrode |
| Crocodile clip | Electrophysiology Equipment | Pomona | AL-B-12-0 | |
| Electric cable | Electrophysiology Equipment | Pomona | B-36-0 | Test Cable Assembly |
| 2 electrode holders | Electrophysiology Equipment | Syntech | N/A | Electrode holders (set of 2) for tungsten wire electrode |
| AC probe | Electrophysiology Equipment | Syntech | N/A | Universal single ended probe (10xAC) |
| Tungsten electrodes | Electrophysiology Equipment | Microprobes | M210 | straight tungsten rods, 0.005x3 |
| Potassium hydroxide | Electrophysiology Equipment | Sigma-Aldrich | 221473 | |
| Syringe | Electrophysiology Equipment | BD Biosciences | 301625 | 20 mL |
| Power supply | Electrophysiology Equipment | Wild Heerbrugg | e.g MTR32 | |
| Vertical puller | Insect prep | Narishige International | PB-7 | |
| Razor blade | Insect prep | VWR international | 55411-050 | |
| Dental wax | Insect prep | Patterson | 091-1503 | |
| Microscope slide | Insect prep | Fisher Scientific | 12-550A | |
| Cover glass | Insect prep | Fisher Scientific | 12-541A | 18X18 #1.5 |
| Polypropylene mesh | Insect prep | Small Parts, Inc. | CMP-0500-B | |
| Glass electrode | Insect prep | Frederick Haer and Co. | 27-32-0-075 | Capillary tubing borosilicate 1.5mm OD x 1.12mm ID x 75 mm |
| Double-sided tape (3M) | Insect prep | 3M | MMM6652P3436 | Double-sided tape (3M) |
| Forceps | Insect prep | Fine Science Tools | 021x0053 | Dumont #5 Mirror Finish Forceps |
| Small plastic cup | Insect prep | VWR international | 89009-662 | 7 x 5.7 (23/4 x 21/4) |
| Electric aspirator | Insect prep | Gempler’s | RHM200 |
References
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