Summary
Электрофизиологические ответов обонятельной сенсорных нейронов отдушки могут быть измерены в насекомых с помощью одного записей сенсиллы. В этом видео статье мы покажем, как для выполнения разовых записей в сенсиллы антенны уксуса летать (
Abstract
Обоняние имеет важное значение для насекомых, чтобы найти пищу, братцы, хищников и яйцекладки сайтов 3. Насекомые обонятельной сенсорных нейронов (OSNs) заключаются в чувствительных волосков называется сенсиллы, которые покрывают поверхность обонятельных органов. Поверхности каждой сенсиллы покрыта крошечные поры, через которые проходят отдушки и растворяются в жидкости называется сенсиллы лимфы, которая омывает сенсорных дендритов OSNs размещены в данном сенсиллы. OSN дендритов выразить рецепторов одоранта (ИЛИ) белков, что у насекомых функции, как запах закрытого ионных каналов, 4, 5. Взаимодействие пахучих веществ с помощью ОРС либо увеличивает или уменьшает базальную скорость стрельбы из OSN. Это нейронной активности в виде потенциалов действия воплощает в себе первое представление качества, интенсивности и временных характеристик одоранта 6, 7.
Учитывая легкий доступ к этим чувствительными волосками, можно выполнять внеклеточной записи с одного OSNs путем введения электрода в записи сенсиллы лимфы, в то время как электрод помещается в лимфатических глаза или тело насекомого. У дрозофилы, сенсиллы дома от одного до четырех OSNs, но каждый OSN обычно отображает характерные амплитуды пика. Спайк методы сортировки позволяют назначить пики ответы на отдельные OSNs. Этот сингл сенсиллы записи (ССР) техника мониторы Разность потенциалов между сенсиллы лимфы и электрода сравнения, как электрические шипы, которые создаются активности рецепторов на 1 OSNs, 2, 8. Изменения в число шипов в ответ на одоранта представляют сотовые основе кодирования запахов у насекомых. Здесь мы опишем метод подготовки в настоящее время используется в нашей лаборатории для выполнения ССР дрозофилы и Anopheles gambiae, и показать представителю следы индуцированных одорантов в сенсиллы конкретным образом.
Protocol
1. Запах разведения
- Большинство отдушки растворимы в керосин. Тем не менее, ДМСО или этанол может также использоваться в качестве альтернативных растворителей для определенных запахов. Подготовка соответствующих разведениях (например 1:10 Объем: объем, по объему) из чистого отдушки в стеклянных флаконах. Большинство разведения запах стабильны при комнатной температуре, но для легколетучих соединений лучше, чтобы сделать работу разведений на еженедельной основе. Каждый сенсиллы реагирует на различные запахи в другой диапазон концентрации. Для дрозофилы, полезной справочной таблицы для соответствующих концентраций для использования с данной сенсиллы могут быть найдены в 6, 7.
Для видео-эксперимент, мы используем парафинового масла в качестве растворителя контроля и метилацетат (10 -6 V: в парафиновое масло) и 1-octen-3-ол (10 -7 V: в керосин) для дрозофилы и Anopheles записей, соответственно. - Использование ножницы, разрезать бумажной хроматографии на 3 мм х 5 полос см так, что они будут соответствовать в пипетки Пастера.
- Внесите 30 мкл желаемый аромат на фильтр полосы бумаги и вставить его в стеклянной пипетки. Вырезать ~ 3 см труб воздушной линии и вставьте его в открытый конец пипетки, закрывая его с разъемом. Разъем используется для уплотнения пипетка, которая будет затем прикрепляется к воздушной линии трубы из воздушного насоса, когда пришло время поставить запах во время эксперимента.
2. Запах системы доставки
- С помощью небольшой сверлить, вырезать 10 мл пластиковых серологические пипетки (например, в 4 мл отметки) и создать два отверстия (например, на -1,5 и -0,5 мл мл марок), которые будут использоваться для хранения пипетки содержащей запахи. Вставить 200 мкл наконечник пипетки в колючей муфтой и ввести ответвитель в тупой конец 10 мл пипетки. Пипетки будет использоваться как часть системы доставки для отдушки.
- Прикрепить пипетки на магнитной подставке с пипеткой зажим и поместите его рядом с микроскопом.
3. Заточка электродов
- Чтобы заострить электроды, подготовить 0,5 М раствора гидроксида калия (КОН) и фильтр, чтобы удалить мелкие частицы (например, используя 45 мкм фильтр). Возьмите 20 мл шприц и делают небольшое отверстие (~ 2 мм в диаметре) с помощью иглы на стене рядом с наконечником (~ 1 см от кончика), в котором электрический провод вставляется (рис. 1А).
- Заполните шприц с 0,5 М КОН, и закрепите на подставке под микроскопом, чтобы головка помещена в поле зрения (рис. 1В, С). Вставьте электрический провод в маленькое отверстие на шприц стене (рис. 1В), убедившись, что провод не прямо перед входом в шприц. Подключите этот провод к катоду источника постоянного тока (например, Дикий Heerbrugg MTR32 см. Методы) или полюс питания переменного тока (например, Дикий Heerbrugg-990018 LEP). Прикрепите вал держатель электрода на ручной микроманипулятора на правой стороне микроскоп, и приложить электрический кабель в основании вала держателя электрода с крокодил. Подключите кабель к аноду источника питания постоянного тока или другому полюсу источника питания переменного тока (рис. 1А).
- Вставьте вольфрамовой проволоки (~ 5 см длины) в держатель электрода, и приложите его к валу держатель электрода на манипуляторе. Установить источник питания 6 В, и вставьте кончик провода в шприц несколько раз, чтобы отточить его, стараясь контролировать наконечник под микроскопом во время процесса (рис. 1в). Для получения идеального электрода для записи, место 90% его длины в растворе в течение 1 мин, а вытащить его медленно. Затем вставьте только ~ 50% от электрода к дальнейшему тонкий в течение 30 с, и повторить его, чтобы получить кончик проволоки заостренным (~ 10 раз).
Кончик электрода должна быть достаточно тонкой, чтобы вступить в сенсиллы, но не так хорошо, как согнуть, когда он касается ее во время записи (шаги 6 и 7). Хотя смотреть электрода при вскрытии микроскопом во время его заостренным является хорошим показателем того, его толщину, только глядя на него под микроскопом записи при большом увеличении даст четкое представление о том, является ли данный электрод пригоден для записи.
4. Насекомые приготовительная: Drosophila антенны
- Сборка летать аспиратора. Отрежьте кусок трубы воздушной линии достаточно долго, чтобы повесить комфортно на шее (около 90 - 120 см). Отрежьте кончик 200 мкл кончика пипетки и вставить его в один конец трубки. С другой стороны, позиция ~ 1,5 см х 1,5 см кусок сетки так, что он создает физический барьер, но не предотвращает воздуха из вытекающей из трубки. Отрежьте кончик 1 мл кончика пипетки и положение широким концом на верхней части трубки открытия, блокировка сетка между ними. Эта часть будет использована, чтобы забрать и манипулировать взрослых мух уксуса (рис. 2).
- Возьмите предметное стекло и место кусок зубных слепков примерно в середине длинной стороны. На вершине ее positioН. А. покровного стекла слегка наклонена вверх (~ 30), убедившись, что воск не непосредственно под самой верхней части, которая будет препятствовать визуализации уксуса летать под микроскопом. Вытяните стеклянного электрода с вертикальной съемника. Его кончик должен быть тонким и достаточно гибкой, чтобы поместиться в период между второй и третий членик, и держите стабильный антенны для записей. Позиция стеклянного электрода на другой кусочек воска и поместите его на стороне покровного стекла, достаточно далеко, что, когда кончик опускается она достигает угла покровного стекла (рис. 3А).
- Работа на бутылку или флакон взрослых мух от желаемого генотипа, подобрать взрослого летать уксуса использованием летать аспиратора. Хотя женщины, как правило, используются из-за своих больших размеров, мужчины также могут быть использованы. Место 200 мкл кончиком пипетки на вершине 1 мл кончик, чтобы избежать летать убежать. Удар в трубку, так что муха толкают к концу 200 мкл кончиком пипетки. Trim широкий конец пипетки с лезвием несколько миллиметров от летают себе, затем вставить некоторые воском, чтобы предотвратить летать из поддержку из. Под микроскопом, вырезать снова у изголовья уксуса летать, обращая внимание, чтобы не повредить животное. С небольшой кончик пипетки, нажмите воском, чтобы заставить летать голову так, что около половины из глаз выдавить из наконечника (рис. 3В). Убедитесь в том, что ее ноги не выходят, а, или они могут двигаться и мешать записи.
- Горы летать на кусок воска, голову вверх, и поместить его на слайд в передней части покровного стекла. Нажмите голова слегка против углу стекла, так что антенны расширить и отдых на стекле. Нижняя оконечность стеклянный капилляр в период между второй и третий членик (рис. 3В).
- Различные части антенны даст доступ к различным типам сенсилл. В зависимости от конкретных экспериментальных потребностей, антенны должны быть ориентированы по-разному, чтобы разрешить доступ к различным типам сенсилл. Для записи с большим basiconic сенсилл как в нашем примере, ость выталкивается вниз на стекло (рис. 3В).
5. Насекомые приготовительная: Anopheles Челюстные щупики
- Используя электрический аспиратор (рисунок 2E), собирают от 40 до 60 3-5 дней комаров (смешанные мужчины и женщины) в маленькой клетке пластиковые (рис. 2F). Комары должен был воспитан в нормальных условиях, т.е. в насекомое инкубатора или insectary при 25-28 ° С и 70-80% влажности. Место небольшие пластиковые клетки с животными на льду в течение ~ 15 мин, пока они не под наркозом от холода. Как только у животных перестал двигаться, передача всего 4-6 животных на сцену под микроскопом в любой момент времени, сохраняя остальные животные на льду во время процедуры. Хотя женщины, как правило, используются из-за их чувствительности к CO 2, самцы могут быть также использованы. Выберите женского или мужского пола комаров, судя по структуре их антенны (перистые у женщин, нитевидные у мужчин), и удалить их крылья и ноги с тонкими щипцами для иммобилизации их. Храните их в маленькую чашку пластика с мокрой бумаги на дне, чтобы предотвратить их осушающий.
- Положите два кусочка двухсторонней ленты (~ 1 см в длину) параллельно друг другу (~ 1 см друг от друга), в центре и на стороне предметное стекло (рис. 3С). Использование тонких щипцов, поместите один комар на центральную ленту под рассекает микроскоп, и превратить его в сторону и придерживайтесь его тело и один глаз на ленту. Отрегулируйте положение верхнечелюстного щупальца так, чтобы оба щупальца проходят параллельно на ленте (рис. 3D). Fix верхнечелюстного щупальца, помещая тонкие струны (например, человеческий волос) как на основание и на кончике щупиков (рис. 3D). Стороны лента используется в качестве хранилища для тонких струн, в то время как центральные ленты должен быть заменен после каждой записи (рис. 3С).
6. Запись дрозофилы
- Место слайд под микроскопом (рис. 4А) при малом увеличении и положение антенны примерно в середине поля зрения (FOV) (рис. 4В). Осторожно опустите электроды таким образом, чтобы электрод расположен вблизи глаз летать и записи электрода вблизи антенны (рис. 4С). Увеличение увеличение и повторно положение антенны в середине поля зрения (рис. 4D).
- Место доставки устройства запах близкой к главе летать, указывая на антенну.
- На малом увеличении (рис. 4С), вставить электрод в глаз мухи. Уменьшите электрода на верхней части антенны, не касаясь его поверхности.
- Переход на большом увеличении, контроль записи электрод с микроманипулятора и вставить его в выбранный сенсиллы (рис. 4D). Любая точка по длине сенсиллы хорош для записи. Оказавшись внутри сенсиллы, электрод может быть выдвинут дальше в (иногда все путем)для получения лучшего отношения сигнал-шум. Как только электрод в сенсиллы, спонтанной активности клетки могут быть обнаружены.
7. Запись Anopheles gambiae
- Место предметное стекло под микроскопом при малом увеличении (10х) и положение верхнечелюстного щупальца примерно в середине поля зрения и головы в верхней (рис. 4E). Поворот этапе, пока один из щупальца находится в прямой угол с записью электрода.
- Отрегулируйте высоту электроды таким образом, чтобы электрод позиционируется чуть выше глаз комаров и записи электрода близок верхнечелюстной щупиков.
- Место устройства запах доставки так, чтобы она как можно ближе к щупиков.
- Вставьте электрод в глаза при более низких увеличением (10x), и переход к более высоким увеличением (100х), вставить электрод в записи привязки сенсиллы на щупика (рис. 4F). Как только электрод в сенсиллы, спонтанной активности клетки могут быть обнаружены.
8. Представитель результаты
В зависимости от сенсиллы и качество записи, можно выделить разное число обонятельных нейронов в пределах одного следа. В больших basiconic сенсилл дрозофилы, например, между 2 и 4 клетки, которые отличаются по амплитуде шип должны появиться во время записи 9, 10.
В нашем видео-эксперимент, дрозофилы ab2 сенсиллы показаны две клетки, клетки (рис. 5, синий шипы) и В-клеток (рис. 5, зеленый шипы). Ни клетка активируется во время нанесения парафинового масла (рис. 5А), в то время как только клетка реагирует на 10 -6 разбавления метилацетат (рис. 5B).
В верхнечелюстной щупика из Anopheles gambiae, рифленые колышек сенсиллы содержит три ячейки, но только два легко дискриминации (рис. 5C, синий и зеленый шипы, соответственно). В видео-эксперимент мы покажем, как В-клеток в ответ на 10 -7 разведении 1-octen-3-ол (рис. 5D).
Рисунок 1. Электроды точилку
(А) Общий вид аппарата электрода точилка. (B) шприц, содержащий 0,5 М КОН (слева), используемый для точить электрод (справа). (С) Крупным планом электрода рядом с открытия шприц.
Рисунок 2. Как подготовить аспиратор летать и комаров аспиратор
() Исходный материал:... Воздушной линии пластиковые трубы, два совета сократить пипетки и сетки (Б) летать аспиратор после ее завершения (С) Деталь конец, который ловил мух уксуса (D) Деталь Другой конец лету аспиратор. (E) электрический аспиратор для москитных коллекция состоит из основного корпуса и съемная пластиковая клетка. (F), съемные пластиковые клетки для комаров.
Рисунок 3. Подготовка уксуса мушки (дрозофилы) и малярийного комара (Anopheles gambiae) для записи
(А) Изображение уксуса летать установлен на слайд Перед установкой его под микроскопом. (B) крупным планом головы летают уксус с антенной хранится на месте с помощью стеклянного капилляра. (С) Изображение комаров монтируются на слайда. (D) Крупный план комаров голове хоботок и торчащие щупальца на ленте.
Рисунок 4. Запись с уксусом мушки (дрозофилы) и малярийного комара (Anopheles gambiae)
() Вид установки электрофизиологии. (B) крупным планом лететь подготовки установленных на микроскопе. Обратите внимание на соответствующее положение записи электрода (слева), система запахов доставка (в середине пипетки), а также записи электрода (справа). (С) Изображение летать под 10x цели. (D) Изображение летать под антенну 100x цели;. большой basiconic сенсилл (стрелки), вкрапленные среди не-сенсорные волоски (наконечники стрел) (E) 10x зрения комара установлен для записи (F) Высокая зрения увеличения щупика комаров и привязка сенсиллы (стрелка). .
Рисунок 5. Примеры записей из дрозофилы иAnopheles gambiae
(А) сенсиллы ab2 дрозофилы расположены две сенсорные нейроны,.. Клетки (синие шипы) и В-клеток (зеленые шипы) (В) и В-клеток при применении 10 -6 метилацетат (С) колышек сенсиллы из Anopheles gambiae расположены две сенсорные нейроны, клетки (синие шипы) и В-клеток (зеленые шипы) (D) Применение 10 -7 1-octen-3-ол на колышек сенсиллы..
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Обонятельные сигналы используются организмами для определения источников пищи, потенциальных партнеров, а также хищников. Обонятельные сенсорные нейроны (OSNs) являются первым центром реле между внешними стимулами и высшие центры мозга, где информация дальнейшей обработке. В дрозофилы и Anopheles gambiae, OSNs легко доступны, и их электрическая активность можно наблюдать в то время как стимулируется запахом затяжек.
Одного сенсиллы записи (ССР) технику, приведенными в этом видео было широко используется для записи с OSNs и изучения их электрических ответов на большое количество отдушек 6, 7. Deorphanization обонятельных рецепторов (ОР) 6, 11 и отображение ОШ в определенных местах на Drosophila антенны 9, 12, 13 сделал ССР техника мощный инструмент для анализа электрофизиологических свойств конкретных ОШ в естественных условиях, в качестве первого шаг, чтобы понять, каким образом внешние обонятельный мир переведены на электрические сигналы через свои OSNs и в конечном счете воспринимаются животным.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraffin oil | Odors | Fluka | 76235 | |
| High purity odors (>98%) | Odors | Sigma-Aldrich | Methyl acetate #296996 1-octen-3-ol #74950 |
|
| Filter paper strips | Odors | Fisher Scientific | 05-714-1 | Chromatography paper |
| Connectors | Odors | Cole-Parmer | EW-06365-40 | 1/16x1/8" |
| Glass vials | Odors | Agilent Technologies | 5182-0556 | |
| Air line plastic tubing | Odor Delivery | Python Products | 500PAL | |
| 1 serological pipette | Odor Delivery | Corning | 4101 | 10 mL |
| Plastic tubing | Odor Delivery | Cole-Parmer | EW-06418-0 | 0.050"x0.090"OD |
| Disposable borosilicate glass Pasteur pipettes | Odor Delivery | Fisher Scientific | 13-678-20A | 5-3/4 inches |
| Programmable stimulus controller | Odor Delivery | Syntech | CS-55 | |
| Anti-vibration table | Electrophysiology Equipment | TMC | 63533 | 36”Wx30”Dx29”H |
| Faraday cage | Electrophysiology Equipment | TMC | MI8133303 | |
| Inverted microscope | Electrophysiology Equipment | Nikon Instruments | E600FN ECLIPSE | Recording microscope |
| 10x and 100x objectives | Electrophysiology Equipment | Nikon Instruments | 10x Plan Fluor 100x L Plan | |
| Dissecting microscope | Electrophysiology Equipment | Nikon Instruments | EZ645 | electrode sharpening/insect prep microscope |
| Magnetic stands | Electrophysiology Equipment | Newport Corp. | MODEL 150 | |
| IDAC | Electrophysiology Equipment | Syntech | IDAC-4 | |
| Acquisition software | Electrophysiology Equipment | Syntech | Autospike | |
| 1 macromanipulator | Electrophysiology Equipment | Narishige International | MN-151 | Joystick manipulator Used for positioning reference electrode |
| 1 micromanipulator | Electrophysiology Equipment | EXFO | PCS-6000 | Used for positioning recording electrode |
| Crocodile clip | Electrophysiology Equipment | Pomona | AL-B-12-0 | |
| Electric cable | Electrophysiology Equipment | Pomona | B-36-0 | Test Cable Assembly |
| 2 electrode holders | Electrophysiology Equipment | Syntech | N/A | Electrode holders (set of 2) for tungsten wire electrode |
| AC probe | Electrophysiology Equipment | Syntech | N/A | Universal single ended probe (10xAC) |
| Tungsten electrodes | Electrophysiology Equipment | Microprobes | M210 | straight tungsten rods, 0.005x3 |
| Potassium hydroxide | Electrophysiology Equipment | Sigma-Aldrich | 221473 | |
| Syringe | Electrophysiology Equipment | BD Biosciences | 301625 | 20 mL |
| Power supply | Electrophysiology Equipment | Wild Heerbrugg | e.g MTR32 | |
| Vertical puller | Insect prep | Narishige International | PB-7 | |
| Razor blade | Insect prep | VWR international | 55411-050 | |
| Dental wax | Insect prep | Patterson | 091-1503 | |
| Microscope slide | Insect prep | Fisher Scientific | 12-550A | |
| Cover glass | Insect prep | Fisher Scientific | 12-541A | 18X18 #1.5 |
| Polypropylene mesh | Insect prep | Small Parts, Inc. | CMP-0500-B | |
| Glass electrode | Insect prep | Frederick Haer and Co. | 27-32-0-075 | Capillary tubing borosilicate 1.5mm OD x 1.12mm ID x 75 mm |
| Double-sided tape (3M) | Insect prep | 3M | MMM6652P3436 | Double-sided tape (3M) |
| Forceps | Insect prep | Fine Science Tools | 021x0053 | Dumont #5 Mirror Finish Forceps |
| Small plastic cup | Insect prep | VWR international | 89009-662 | 7 x 5.7 (23/4 x 21/4) |
| Electric aspirator | Insect prep | Gempler’s | RHM200 |
References
- Boeckh, J. Elektrophysiologische Untersuchungen an einzelnen Geruchsrezeptoren auf der Antenne des TotengrAbers (Necrophorus Coleoptera). Z. Vergl. Physiol. 46, 212-248 (1962).
- Schneider, D., Hecker, E. Zur Elektrophysiologic der Antenne des Seidenspinners Bombyx mori bei Reizung mit angereicherten Extrakten des Sexuallockstoffes. Z. Naturforschg. 11b, 121-124 (1956).
- Touhara, K., Vosshall, L. B. Sensing odorants and pheromones with chemosensory receptors. Annu Rev Physiol. 71, 307-332 (2009).
- Sato, K. Insect olfactory receptors are heteromeric ligand-gated ion channels. Nature. 452, 1002-1006 (2008).
- Wicher, D. Drosophila odorant receptors are both ligand-gated and cyclic-nucleotide-activated cation channels. Nature. 452, 1007-1011 (2008).
- Hallem, E. A., Ho, M. G., Carlson, J. R. The molecular basis of odor coding in the Drosophila antenna. Cell. 117, 965-979 (2004).
- Hallem, E. A., Carlson, J. R. Coding of odors by a receptor repertoire. Cell. 125, 143-160 (2006).
- Boeckh, J., Kaissling, K. E., Schneider, D. Insect olfactory receptors. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 30, 263-280 (1965).
- de Bruyne, M., Foster, K., Carlson, J. R. Odor coding in the Drosophila antenna. Neuron. 30, 537-552 (2001).
- Lu, T. Odor coding in the maxillary palp of the malaria vector mosquito Anopheles gambiae. Curr Biol. 17, 1533-1544 (2007).
- Hallem, E. A., Fox, A. N., Zwiebel, L. J., Carlson, J. R. Olfaction: mosquito receptor for human-sweat odorant. Nature. 427, 212-213 (2004).
- Couto, A., Alenius, M., Dickson, B. J. M. olecular anatomical, and functional organization of the Drosophila olfactory system. Curr. Biol. 15, 1535-1547 (2005).
- Fishilevich, E., Vosshall, L. B. Genetic and functional subdivision of the Drosophila antennal lobe. Curr Biol. 15, 1548-1553 (2005).
