Summary
Ayrıntılı bir protokol görüntüleme için DNA onarım komplekslerin gerçek zamanlı oluşumu açıklanmıştır
Abstract
Hem prokaryot ve ökaryotlarda DNA hasarı karmaşık bir dizi fizyolojik değişiklikler ile yanıt verir. Gen ekspresyonu, mevcut proteinlerin yeniden dağıtımı ve yeni protein kompleksleri montaj değişiklikler DNA lezyonları ve eşleşmeyen DNA baz çifti çeşitli teşvik edilebilir. Floresan mikroskopi DNA lezyonları ve karmaşık hücre içi mimari canlı bir hücre içinde DNA replikasyon durumunu izlemek için bu ve diğer tepkiler görselleştirilmesi ve ölçülmesi için güçlü bir deney aracı olarak kullanılmıştır. , Floresan muhabiri proteinleri ve DNA replikasyonu ve tamiri makine bileşenleri arasında Translasyonel füzyonlar ipuçlarını belirlemek için kullanılan hedef DNA onarım proteinleri cognate lezyonlar
Protocol
Mikroskopi için hücrelerin Büyüyen kültürlerin
1. Bir veya iki gün önce görüntüleme, B. hazırlamak subtilis görselleştirmek için istediğiniz translasyonel füzyon proteini içeren süzün. Adımları 1A ve 1B Deneme turlarında, büyüme durumu suşu en iyi görüntüyü sağlayan belirlemek için gerekli olacaktır. Çoğu durumda, hücreler, üstel büyüme aşamasında görüntülü olmalıdır.
- Bazı B. subtilis suşları (endojen lokustaki ilgi ve GFP geninin arasında translasyonel füzyon entegrasyonu nedeniyle yetersiz büyümeye, özellikle suşları), görüntüleme için iki gün önce ilk büyüme, yüksek kaliteli görüntüler için gerekli . Ilk gününde, çizgi B. subtilis seçici antibiyotik (ler) ile LB agar yansıması zorlanma ve 30 ° C'de bir gece inkübe Ikinci gününde, tek bir koloni ile 100 ul 0.85% serum fizyolojik aşılamak ve 30 gece inkübasyon tarafından her seyreltme 100 mcL kaplama LB agar plakaları üç 10 kat seri dilüsyonları (seçici antibiyotikler ile), ° C gerçekleştirmek Üçüncü gününde, hücrelerin ışık konfluent büyüme ile seyreltme plaka seçin. Bir tabak Işık konfluent büyüme potansiyel (adım 4) mükemmel görüntüleme sonuçlar, katlanarak büyüyen sağlıklı bir başlangıç inokulum ile büyüme ortamı sağlayacaktır. Bu adım, leke FM4-64 ile en yüksek kaliteli membran görüntüleme için yararlıdır.
- B. Diğer subtilis suşları sadece steril bir çubuk görüntüleme için önceki gün ile tek koloniler için seçici LB agar uygulanacak ve 30 ° C'de bir gece inkübe Ertesi gün, bu plaka üzerinde hücreler (adım 4) görüntüleme için bir inokulum olarak kullanmak yeterli olacaktır.
NOT: B. subtilis, sıvı bir ortamda geceleme kültürleri 1 lag fazı büyüme bir süre neden spor oluşumu ve yeter tepkiler, bir kombinasyonu nedeniyle uygun değildir.
2. Görüntüleme, yerine 10 ml, 125 ml steril Erlenmeyer şişesinin içine S7 50 1-3 orta sabahı .
3. Inokulum elde etmek için tek koloniler veya ışık konfluent hücreleri LB agar plaka S7 50 orta 2 ml kadar hücrelerin yeniden süspanse edin.
4. ~ 0.08 0.1 ila 600 nm dalga boyunda ölçülen bir ilk optik yoğunluk (OD 600) ile 10 ml S7 50 orta bir kültür içeren Erlenmeyer şişesi yeterli S7 50 orta hücre inokulum ekleyin. Bu aşamada, en az 10 kat hava orta oranı olması önemlidir. Böylece, 10 - 12.5 ml 125 ml Erlenmeyer şişesinin inoküle orta kullanın.
5. Kültür OD 600 ~ ulaşır 0.5-0.8 ° C ye kadar her 30 kültür büyütün. Çalkalamalı su banyosu, 150-200 dakikada devrimlerle tercih edilmektedir. DNA'nın zarar veya uyumsuzluğu indükleyici ajanlar ile meydan Kültürler erken bir üstel büyüme aşamasında olmalıdır OD 600 hücrelerin (bkz. Tablo 1), tedavi için gerekli olan büyüme ek süre ile OD 600 hedefe ulaşmak olacağını ,
Örneğin, 2-aminopurine bir tedavi saat, 2 aminopurine ile tedavi edilen bir kültür ve bu nedenle tedavi bir OD 600 / büyüme sonuçlar bir saat ~ 0.5-0.8 gibi, OD 600 ~ 0.3-0.4 olmalıdır gerektirir. sayede hücreleri görüntüleme için hazır.
Numune Hazırlama
1. Pipet, 1.5 mL mikrosantrifüj tüpe kültür hücreleri 300 ul.
2. Hücre zarının görüntüleme isteniyorsa, 1 mg / ml stok solüsyonu leke FM4-64 membran (Invitrogen) her numune için 1:1000 dilüsyon ekleyin. FM4-64 A titrasyon istenen floresan sinyal elde etmek için gerekli olabilir. Tipik bir titrasyon aralığı, 1:100, 1:1000 ve 1:10,000.
3. Örnekleri, aşağıda açıklandığı gibi slayt 1X Spizizens orta% 1 agaroz ile hazırlanmakta olan ise, on dakika kadar veya oda sıcaklığında oturmak (bkz: adım 1 "slayt hazırlama") izin verin.
4. Hücre konsantrasyonu gerekiyorsa, biz, bir vakum cihazı ile filtre 0.2 mikron kullanarak filtreleme hücreleri tercih ediyor. Hücreler daha sonra PBS, uygun başka bir tampon veya görselleştirme önce orta filtre yüzeyinden nazikçe yıkanabilir.
Slayt hazırlanması
1. 1X Spizizens% 1 agaroz hazırlayın.
5 ile 0.5 g agaroz ile birlikte 10X Spizizens stok ml 45 ml ddH2O ve eritmek için mikrodalga ekleyin. Sıcak erimiş agaroz pipetle zor ve agaroz pipet girmez pekiştirdi. Agaroz ° C pipet girmek için içinde katılaşabilme olmadan, bir sıcaklık 55-65 ~, bir su banyosu içinde dengelenmiş olmalıdır ucu.
2. % 1 erimiş agaroz Spizizens 20 ul pipet içine çizin. Agaroz çözüm sığ agaroz pedleri oluşturmak için her slayt (15 iyi slaytlar, bkz. Tablo 2) tek bir damla (yaklaşık 1-2 mcL) Pipet. Agaroz hemen pekiştireceğiz. Slaytlar da hücrelerin uygulamaya hemen önce yapılmalıdır. Agaroz pedleri sadece oda sıcaklığında bırakılırsa, onlar birkaç dakika içinde kurutmak ve kullanılamaz hale gelebilir.
Agaroz pedleri merkezli ve her doldurmak iyi ama lamel bozmamak için en az yüksekliğe sahip olmalıdır; damlacıkları (baloncuk) gibi çok yüksek ya da örnek de sınır ötesine yayılır, sadece tokatlamak bir Kimwipe iyi temiz ve uygulamak Yeni agaroz ped.
3. Her agaroz pad üstüne dağıtılan slayt, tüm 300 ul örneği (bkz. adım 6) uygulayın. Bu hücre miktarı slaytta her iyi karşılamak için yeterli olmalıdır.
4. Yaklaşık on dakika boyunca oda sıcaklığında (23 ° C) oturup hücreleri yüklü slayt izin verin. Bu adım, agaroz ped hareketsiz görüntüleme için ve hazır olma niyet hücreler için izin verecektir. Bir sıcaklık değişimi 4 gerektiren deneyler yaparken, özel ihtiyaçları için bu sıcaklık, örneğin, değiştirilmesi gerekebilir .
5. Pedleri kendileri çıkarmadan her kuyudan fazla orta aspire edin.
6. Slayt alanı boyunca, yavaşça ve eşit sıkıca basarak, ancak, slayt lamel uygulayın. Kapak kayma, slayt karşı ve kapak kayma slayt üzerinde yükseltilmiş değildir olduğundan emin olmak için kontrol edin.
Hücre Görselleştirme
1. Birçok farklı floresans mikroskopları iyi çalışacaktır. 100X immersiyon yağı lens için kritik öneme sahiptir. Simmons Lab kullanır:
- Olympus BX61 mikroskop 1,45 NA TIRFM 100X immersiyon yağı objektif lens ile donatılmış
- Hamamatsu ORCAR 2 CCD kamera soğutmalı
- Lümen 200 ark metal (Önceki) ışık kaynağı.
- GFP (FITC), filtre uyarma 460-500 ve 510-560 emisyon tespiti için
- FM4-64 (TRITC), filtre, uyarma 510-560 ve emisyon 572-648 tespiti için.
- Görüntüler SlideBook 4.2 (Şekil 1) kullanarak ele geçirildi
2. Hücreleri, beyaz ışık kullanarak odak noktası haline getirin.
3. Her fluorofor için uygun filtreleri kullanarak görüntü yakalayın.
Temsilcisi Sonuçlar
Temsilcisi görüntüleri (Şekil 1). FM4-64 boyama 4-7 parlak ve net olmalıdır GFP odakları, iyi tanımlanmış olmalıdır. GFP veya membran görüntüleri herhangi bir veri kaybı olmadan sunulacak en yüksek kalitede görüntü için izin vermek için herhangi bir renk ile sözde renkli olabilir.
Şekil 1: B. Temsilcisi GFP görüntüleri FM4-64 membran boyanması kırmızı ile gösterilen ise subtilis translasyonel füzyon proteinleri GFP proteinler, yeşil gösterilmiştir. Beyaz ölçek çubuğu 3 mikron gösterir (A) bisiklet, GFP ilgili genotip: bisiklet, GFP (spc), amyE: Pspac mutL (kedi)] 600 mg / ml 2-aminopurine ve 1 mM IPTG varlığı. FM4-64 sinyal bisiklet, GFP odakları daha net bir şekilde göstermek amacıyla sunulan değildir (B) MutL GFP [ilgili genotip: mutL: mutL-GFP (spc)]. 2-aminopurine varlığı (C) DnaX-GFP [ilgili genotip: dnaX: dnaX-GFP (spc)]. (D) reca-GFP ilgili genotip: Reca: reca-GFP (spc)] varlığı 20 ng / ml mitomisin C (E) TagC-GFP [ilgili genotip: tagC: tagC-GFP (spc) 1 mcg / ml mitomisin C varlığı]
| Tedavi / konsantrasyon veya miktarı | Fonksiyon | Inkübasyon süresi |
| Mitomisin C (MMC) [20 - 150 ng / ml] | DNA ajan alkilleyici | 1 saat |
| 2-aminopurine (2-AP) [600 mg / ml] | uyumsuzluğu indükleyici | 1 saat |
| Hidroksiüre (HU) | dNTP tüketir | 3 saat |
| ultraviyole ışınları (UV) 20 J/m2 | Timin-timin dimerleri ve 6-4 photoproducts | 20 saniye, genellikle kaynağına bağlı olarak değişir. |
| griler (iyonizan radyasyon) 5 100 Gy | Çift iplikli sonları, tek zincirinde kırılmalara ve baz hasarı siteleri | kaynağına bağlı olarak değişir. |
| Reaktifin Adı | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar (isteğe bağlı) |
| Multi slayt, 15-iyi | MP Biyomedikal | 6041505E | |
| Mikroskop Kapak Camlar | Balıkçı | 12-544-B | |
| Agaroz | Balıkçı | BP160-500 | |
| Mitomisin C | Sigma | M0503-2MG | mutagen, eldiven |
| 2-Aminopurine | Sigma | A3509-250mg | eldiven |
| Hidroksiüre | Sigma | H8627-25G | eldiven |
| FM4-64 | Invitrogen | T13320 | ışığa karşı hassastır |
Tablo 2. Özel reaktifler ve ekipman listesi:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Deneme ve yanılma her suşu için yüksek kaliteli görüntüler için maruz kalma koşullarını bulmak için gereklidir; 100 2000 ms pozlama GFP (FITC) ve FM4-64 için uygun iken, 1 milisaniye beyaz ışık görüntüler için uygun olduğunu bulmak (TRITC ) görüntüleri. Pozlama süresi kullanılan görüntüleme cihazları bağlı olarak değişecektir. Biz, aynı slaytta birden fazla suşları mevcuttur ped ped sınır hücrelerinin kalite ve difüzyon gerginlik farklılaşma karmaşık hale getirebilir basit görüntüleme için 15 kuyu mikroskop lamı başına bir gerginlik kullanmanızı öneririz. Görüntü kalitesi bakteri dinlenme agaroz ped kalitesi üzerinde doğrudan bağlıdır. Bakteri yan yana yüksek kaliteli görüntüler agaroz pedleri Çekilecek. Bir tek tabaka önlenmesi, gelme bakteri hücrelerinin neden Balatası, kalitesiz görüntüler üretecektir. Susuz olan pedleri hücreleri düzgün bir şekilde dinlenmek için izin vermeyecek çok kalın pedleri, yüksek bir arka plan floresan sinyal üretecektir. Bu agaroz ped hataları genellikle çok kötü görüntü kalitesine yol açacaktır. Iyi kötü görüntüler ise, sadece iyi bir gelecek için hareket ettirin. Resim başına 50 ile 200 arasında hücreleri yakalamak için idealdir. Floresan mikroskobu, DNA onarımı ve çoğaltma proteinleri in vivo odakları içine montaj doğrudan hücresel ipuçlarını ayrıntılı bilgi bir zenginlik sağlamıştır . Uygulama ile, bu tekniği başarıyla birçok bakteri türlerinin protein komplekslerinin çeşitli olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Yazarlar Dr teşekkür etmek istiyorum. Başlangıçta floresan mikroskopi LAS eğitim için Philina S. Lee ve Alan D. Grossman. Yazarlar ayrıca teşekkür Dr. Yardım ve ipuçları görüntüleme için Melanie Berkmen ve Hajime Kobayashi. Bu çalışma, Edebiyat, Fen-Edebiyat Fakültesi ve Michigan Üniversitesi, Moleküler, Hücresel ve Gelişimsel Biyoloji Bölümü start-up fonları tarafından desteklenen oldu.
Materials
| Specific solution recipes1: | |||
| 10x S750 salts 0.5 M MOPS 100 mM Ammonium Sulfate 50 mM Potassium Phosphate Monobasic Filter sterilize, and wrap S750 media in foil prior to storage |
|||
| 100x Metals 0.2 M MgCl2 70 mM CaCl2 5 mM MnCl2 0.1 mM ZnCl2 100 μg/mL Thiamine HCl 2 mM HCl 0.5 mM FeCl3* dH2O to final volume *FeCl3 should be added last, to prevent precipitation. After filter sterilization, wrap 100x Metal solution in foil. |
|||
| S750 media 1x S750 salts 1x Metal 1% Glucose 0.1% Glutamate 40 μg/mL Tryptophan 40 μg/mL Phenylalanine distilled H2O to final volume |
|||
| 10x Spizizens (grams/L) 151.4 mM Ammonium Sulfate (20g/L) 803.8 mM Potassium Phosphate Monobasic (140g/L) 440.9 mM Potassium Phosphate Dibasic (60g/L) 34.0 mM Sodium Citrate (10g/L) 16.6 mM MgSO4 (2g/L) dH2O to final volume Filter sterilize |
References
- Hardwood, C. R., Cutting, S. M. Molecular Biological Methods for Bacillus. , John Wiley and Sons. Chichester. (1990).
- Berkmen, M. B., Grossman, A. D. Spatial and temporal organization of the Bacillus subtilis replication cycle. Mol. Microbiol. 62, 57-71 (2006).
- Simmons, L. A., Grossman, A. D., Walker, G. C. Clp and Lon proteases occupy distinct subcellular positions in Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 190, 6758-6768 (2008).
- Simmons, L. A., Grossman, A. D., Walker, G. C. Replication is required for the RecA localization response to DNA damage in Bacillus subtilis. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 104, 1360-1365 (2007).
- Simmons, L. A., Davies, B. W., Grossman, A. D., Walker, G. C. b Clamp Directs Localization of Mismatch Repair in Bacillus subtilis. Mol. Cell. 29, 291-301 (2008).
- Simmons, L. A. Comparison of responses to double-strand breaks between Escherichia coli and Bacillus subtilis reveals different requirements for SOS induction. J. Bacteriol. 191, 1152-1161 (2009).
- Smith, B. T., Grossman, A. D., Walker, G. C. Visualization of mismatch repair in bacterial cells. Mol. Cell. 8, 1197-1206 (2001).
