Summary
一个详细的协议是描述成像的DNA修复复合物的真正形成时间
Abstract
原核生物和真核生物都通过一个复杂的生理变化响应DNA损伤。在基因的表达，对现有蛋白质的再分配，以及新的蛋白质复合物的组装的改变，可以刺激多种DNA损伤和不匹配的DNA碱基对。荧光显微镜已被用来作为一个强大的可视化和量化这些和其他的反应，DNA损伤和监测在一个活细胞的亚细胞结构的复杂中的DNA复制状态的实验工具。荧光记者蛋白质和DNA复制和修复机制的组成部分之间的翻译融合已被用来确定的线索，其同源性病变的目标DNA修复蛋白
Protocol
显微镜细胞成长的文化
1。前一两天，影像，准备B.枯草芽孢杆菌菌株，包含你想可视化的翻译融合蛋白。步骤1a和1b的审判轮将是必要的，以确定哪些生长条件提供最好的图像你的应变。在大多数情况下，细胞在指数生长期应成像。
- 对于一些B。枯草芽孢杆菌菌株（尤其是株生长不良，由于之间的兴趣和在其内源性的轨迹的绿色荧光蛋白基因的翻译融合整合），成像前两天的初始增长是必要的高质量的图像。在第一天，连胜的B.枯草芽孢杆菌菌株在LB琼脂成像与选择性抗生素（S）在30 ° C过夜孵育第二天，单菌落接种100μL0.85％生理盐水和执行三个10倍连续稀释的LB琼脂平板（选择性抗生素），电镀100μL每个稀释度，其次孵育过夜30 ° C。第三天，选择与光融合细胞生长的稀释板。光一个板块的汇合增长将提供与健康，成倍增长的起动接种潜在收益出色的成像效果（见第4步）的培养基中。这一步是最高质量的FM4 - 64染色膜的成像特别有用。
- 其他B。枯草芽孢杆菌菌株可能只是选择性的LB琼脂培养基单菌落用无菌棒的前一天，影像，并培育在30 ° C过夜翌日，这个板块的细胞，将足以成像接种使用（见第4步）。
注： 为 B 枯草芽孢杆菌在液体培养基中过夜培养，由于不恰当的组合的孢子形成和法定人数的反应，这将导致一个较长时间的滞后期增长 1。
2。在成像，放置10毫升的S7 50 1-3成125毫升的无菌锥形瓶中中等上午。
3。悬浮细胞S7 50中等至2毫升的LB琼脂平板上单菌落或光的融合细胞获得接种。
4。添加足够的S7 50中细胞接种到含有10毫升S7 50培养基中，在600 nm处测初始光密度 （OD 600）〜0.08至0.1的锥形瓶中。在这一步是很重要，至少有一个中等比例的10倍的空气。因此，我们使用10至12.5毫升接种于125 mL锥形瓶中的培养基。
5。每一种文化，文化℃直至达到一个外径600〜0.5-0.8增长30 。从150-200转每分钟振动水浴是首选。文化与DNA损伤或不匹配诱导剂的挑战，应在早期的指数生长期外径600细胞与治疗所需的额外增长期将达到目标的外径600（见表1）
例如，2 -氨基嘌呤，需要一小时的治疗，因此，2 -氨基嘌呤治疗文化应在外径 600〜0.3-0.4，例如，在外径 600治疗/业绩增长的一小时〜 0.5-0.8， 据此细胞成像。
样品制备
1。吸取300μL培养细胞到1.5 ml离心管中。
2。如果需要细胞膜成像，每个样品中加入1:1000稀释FM4 - 64膜染色（Invitrogen公司），从1毫克/毫升的原液。 FM4 - 64滴定可能需要达到理想的荧光信号。一个典型的滴定范围为1:100，1:1000，并1:10,000。
3。允许样品在室温为10分钟或坐而幻灯片正在准备在1X Spizizens介质，用1％琼脂糖如下所述（见“幻灯片准备”的步骤1）。
4。如果细胞浓度是必需的，我们更倾向于使用一个0.2微米的过滤器与真空仪器的过滤细胞。细胞可以轻轻洗净，从表面过滤器，用PBS，另一种合适的缓冲区或中期之前可视。
幻灯片的制备
1。 1％琼脂糖准备1X Spizizens。
添加5毫升0.5 G琼脂糖股票10X Spizizens至45毫升ddH2O，微波融化。热熔融琼脂糖难以吸管，和凝固的琼脂糖不会进入枪头。琼脂糖应该是平衡的水浴温度〜55-65℃，进入枪头没有在固化一角。
2。绘制1％琼脂糖融化到20μLSpizizens枪头。移液器一个单一琼脂糖溶液下降到每张幻灯片（我们使用15以及幻灯片，见表2）形成较浅的琼脂糖垫（大约1-2μL）。琼脂糖将立即巩固。幻灯片也必须立即作出之前，应用细胞。如果琼脂糖垫仅在室温下离开，他们可以在几分钟之内脱水，变得无法使用。
琼脂糖垫应为本，填写每个很好，但有最低的高度，以避免破坏盖玻片;如果水滴过高（泡沫状），或者如果样品以及边界以外的利差，只需轻扫一个Kimwipe以及清洁和应用新琼脂糖垫。
3。整个300μL样本（见第6步），分布在每个琼脂糖垫到幻灯片。这种细胞的数量应足以支付每口井在幻灯片上。
4。允许加载与细胞坐在室温（23℃）约10分钟的幻灯片。这一步将允许细胞琼脂糖垫成为不动，并准备好用于成像解决。对于特殊需求，这可能需要改变温度，例如，进行实验时，需要一个温度变化 4 。
5。取出垫本身没有吸走多余的介质，从每口井。
6。应用盖玻片的幻灯片，稳固地按压均匀，但幻灯片区域，轻轻划过。检查，以确保盖玻片对幻灯片和盖玻片，是不是上面的幻灯片提出。
细胞的可视化
1。许多不同的荧光显微镜，将工作做好。有100X油浸镜头，这是关键。西蒙斯实验室使用：
- 奥林巴斯BX61显微镜配备1,45 NA 100X TIRFM油浸物镜
- 滨松ORCAR 2 CCD相机冷却
- 200流明弧金属（前）光源。
- GFP（FITC），过滤器激发460-500和510-560排放检测
- FM4 - 64（TRITC），过滤器励磁510-560和572-648排放检测。
- 图像捕获SlideBook 4.2（图1）
2。使用白光的重点带入细胞。
3。每个荧光使用适当的过滤器捕捉的图像。
代表性的成果
代表图像显示（图1）。 GFP的疫源地，应明确界定，而应FM4 - 64染色鲜艳和清晰的4-7的。绿色荧光蛋白或膜的图像可以与任何颜色的伪彩色，允许提供最高质量的图像不会丢失任何数据提交。
图1：B 的代表的GFP图像枯草翻译融合蛋白 GFP的蛋白质以绿色显示，而以红色显示FM4 - 64膜染色。白色比例尺表示3微米（一）MutS - GFP [相关基因型：mutS - 绿色荧光蛋白（SPC），amyE：Pspac mutL（CAT）]，在600微克/毫升2 -氨基嘌呤和1毫米的IPTG存在。 （三）FM4 - 64的信号是不是为了更清楚地显示MutS - GFP的灶（二 ）MutL - GFP [相关基因型：mutL：mutL - GFP（SPC）]在2 -氨基嘌呤存在。 DnaX - GFP [相关基因型：dnaX：dnaX绿色荧光蛋白（SPC）]。 （四）RecA蛋白- GFP [相关基因型：recA基因：recA基因，绿色荧光蛋白（SPC）]存在20 ng / mL的丝裂霉素C（E）TAGC - GFP [相关基因型：TAGC：TAGC - GFP（SPC）在1μg/ mL的丝裂霉素C
| 治疗/浓度或数量 | 功能 | 孵化时间 |
| 丝裂霉素C（MMC）[20〜150毫微克/毫升] | DNA的烷基化剂 | 1小时 |
| 2 - 氨基嘌呤（2 - AP）[600微克/毫升] | 不匹配的诱导 | 1小时 |
| 羟基脲（HU） | 耗尽dNTPs | 3个小时 |
| 紫外线（UV）20 J/m2 | 胸腺嘧啶胸腺嘧啶二聚体和6-4光化 | 因取决于源代码，通常为20秒 |
| 灰色（电离辐射）5至100戈瑞 | 双链断裂，单链断裂和基础伤害网站 | 因来源不同而异 |
| 试剂名称 | 公司 | 目录编号 | 评论（可选） |
| Multitest的幻灯片，15 | MP生物医学 | 6041505E | |
| 显微镜盖玻片 | 费舍尔 | 12 - 544 - B | |
| 琼脂糖 | 费舍尔 | BP160 - 500 | |
| 丝裂霉素C | 西格玛 | M0503 - 2MG | 诱变剂，戴手套 |
| 2 - 氨基嘌呤 | 西格玛 | A3509 - 250毫克 | 手套 |
| 羟基脲 | 西格玛 | H8627 - 25G | 手套 |
| FM4 - 64 | Invitrogen公司 | T13320 | 对光敏感 |
表2。特定的试剂和仪器的清单：
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Discussion
试验和错误，需要找到每一株最高质量的图像的曝光条件，我们发现，1毫秒是适当的白色光图像，而100到2000毫秒的曝光是适当绿色荧光蛋白（FITC）和FM4 - 64（TRITC ）图像。取决于所使用的成像设备，曝光时间会有所不同。我们建议每15井显微镜幻灯片应变使用最简单的成像的，垫垫边境细胞的质量和扩散可能株分化的复杂性，多株，如果是同一张幻灯片上。图像质量直接取决于琼脂糖垫细菌休息质量。最高质量的图像将被捕获琼脂糖垫，其中的细菌并排。垫，导致细菌细胞聚集，防止单层，会产生不良的影像。垫，太厚会产生高背景荧光信号，而脱水垫，不会让细胞正常休息。琼脂糖垫这些缺陷通常会导致图像质量非常差。 ，如果一个是产生较差的图像，只需移动的未来以及。它是理想的50和200之间，每幅图像捕捉细胞。荧光显微镜提供了丰富的资料，详细介绍了细胞的线索， 直接灶在体内复制的蛋白质的DNA修复和组装。通过实践，这项技术可以被成功地应用于多种蛋白质复合物，在许多细菌种类。
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Acknowledgments
作者要感谢博士。 Philina S. Lee和艾伦D.格罗斯曼初步培训阿盟在荧光显微镜。作者还感谢博士。梅拉妮Berkmen和肇小林成像的帮助和提示。这项工作是从文学，科学和艺术学院，并在密歇根大学的分子，细胞，和发育生物学部的启动资金支持。
Materials
| Specific solution recipes1: | |||
| 10x S750 salts 0.5 M MOPS 100 mM Ammonium Sulfate 50 mM Potassium Phosphate Monobasic Filter sterilize, and wrap S750 media in foil prior to storage |
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| 100x Metals 0.2 M MgCl2 70 mM CaCl2 5 mM MnCl2 0.1 mM ZnCl2 100 μg/mL Thiamine HCl 2 mM HCl 0.5 mM FeCl3* dH2O to final volume *FeCl3 should be added last, to prevent precipitation. After filter sterilization, wrap 100x Metal solution in foil. |
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| S750 media 1x S750 salts 1x Metal 1% Glucose 0.1% Glutamate 40 μg/mL Tryptophan 40 μg/mL Phenylalanine distilled H2O to final volume |
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| 10x Spizizens (grams/L) 151.4 mM Ammonium Sulfate (20g/L) 803.8 mM Potassium Phosphate Monobasic (140g/L) 440.9 mM Potassium Phosphate Dibasic (60g/L) 34.0 mM Sodium Citrate (10g/L) 16.6 mM MgSO4 (2g/L) dH2O to final volume Filter sterilize |
References
- Hardwood, C. R., Cutting, S. M. Molecular Biological Methods for Bacillus. , John Wiley and Sons. Chichester. (1990).
- Berkmen, M. B., Grossman, A. D. Spatial and temporal organization of the Bacillus subtilis replication cycle. Mol. Microbiol. 62, 57-71 (2006).
- Simmons, L. A., Grossman, A. D., Walker, G. C. Clp and Lon proteases occupy distinct subcellular positions in Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 190, 6758-6768 (2008).
- Simmons, L. A., Grossman, A. D., Walker, G. C. Replication is required for the RecA localization response to DNA damage in Bacillus subtilis. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 104, 1360-1365 (2007).
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