Summary
Um protocolo detalhado é descrito para a formação de imagem em tempo real de complexos de reparo de DNA em
Abstract
Ambos os procariotas e eucariotas responder a danos no DNA através de um complexo conjunto de alterações fisiológicas. Alterações na expressão gênica, a redistribuição de proteínas existentes, ea montagem de complexos de proteínas novo pode ser estimulada por uma variedade de lesões de DNA e de pares de bases incompatíveis DNA. Microscopia de fluorescência tem sido utilizada como uma poderosa ferramenta experimental para visualizar e quantificar as respostas para essas e outras lesões de DNA e para monitorar o status de replicação de DNA dentro da complexa arquitetura subcelular de uma célula viva. Fusões de translação entre proteínas fluorescentes e componentes repórter da replicação do DNA e máquinas de reparação têm sido usados para determinar as sugestões que visam as proteínas do reparo do DNA de suas lesões cognate
Protocol
Culturas em crescimento de células para microscopia
1. Um ou dois dias antes da imagem, prepare o B. subtilis cepa contendo a proteína de fusão traducional você deseja visualizar. Rounds julgamento de passos 1A e 1B será necessário determinar qual condição de crescimento fornece as melhores imagens da sua estirpe. Na maioria dos casos, as células devem ser trabalhada durante a fase de crescimento exponencial.
- Para alguns B. subtilis cepas (em particular, cepas que crescem pouco devido à integração da fusão de translação entre o gene de interesse e GFP em seu lócus endógeno), o crescimento inicial de dois dias antes da imagem é necessário para imagens de alta qualidade. No primeiro dia raia, o B. subtilis estirpe a ser trabalhada em ágar LB com antibiótico seletivo (s) e incubar durante a 30 ° C. No segundo dia, inocular 100 ml de solução salina a 0,85%, com uma única colônia e realizar três de 10 diluições em placas de agar LB (com antibióticos seletiva), chapeamento de 100 L de cada diluição, seguido de incubação durante a noite a 30 ° C. No terceiro dia, selecione a placa de diluição com crescimento confluente luz de células. Crescimento confluente luz sobre uma placa irá fornecer o meio de crescimento com uma alimentação saudável, em crescimento exponencial de inóculo inicial para, potencialmente, produzir resultados excelentes imagens (veja o passo 4). Esta etapa é particularmente útil para a maior qualidade de imagem de membrana com a mancha FM4-64.
- B. Outros cepas subtilis pode simplesmente ser aplicada a meio seletivo agar LB para colônias único com uma vara estéril do dia anterior à imagem e incubar durante a 30 ° C. No dia seguinte, as células nesta placa será suficiente para usar como um inóculo para geração de imagens (veja o passo 4).
NOTA: Para B. subtilis, culturas durante a noite em meio líquido não são apropriados devido a uma combinação de formação de esporos e respostas quorum, o que irá causar um período prolongado de crescimento lag fase 1.
2. Na manhã de imagem, mL colocar 10 de média 50 S7 03/01 em um Erlenmeyer 125 mL estéril.
3. Ressuspender as células em até 2 mL de meio S7 50 da placa de ágar LB com colónias individuais ou as células confluentes luz para obter um inóculo.
4. Adicione o suficiente S7 50 inóculo médio célula para o Erlenmeyer contendo 10 mL 50 S7 meio de uma cultura com uma densidade óptica medida inicial em 600 nm (OD 600) de ~ ,08-,1. Nesta etapa é importante ter pelo menos o ar a 10 vezes a taxa média. Assim, usamos 10-12,5 mL de meio inoculado em 125 mL Erlenmeyer.
5. Crescer cada cultura a 30 ° C até a cultura atingir uma OD 600 ~ 0,5-0,8. Banhos de água balançando são preferidos com rotações por minuto 150-200. Culturas desafiados com agentes indutores danificar o DNA ou o desfasamento deve estar em uma fase inicial de crescimento exponencial OD 600 de tal forma que as células vão atingir a meta de OD 600 com o período adicional de crescimento que é necessário para o tratamento (ver Tabela 1)
Por exemplo, 2-aminopurina requer uma hora de tratamento, e, portanto, uma cultura tratado com 2-aminopurina deve ser a ~ 0,3-0,4 OD 600, de modo que a uma hora de tratamento / crescimento resulta em uma OD 600 ~ 0,5-0,8, pelo qual as células estão prontos para a imagem.
Preparação da Amostra
1. Pipetar 300 mL de células cultivadas em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
2. Se imagens das membranas celulares é desejada, adicione a diluição de 1:1000 FM4-64 membrana mancha (Invitrogen) para cada amostra a partir de uma solução estoque de 1 mg / mL. A titulação de FM4-64 pode ser necessária para atingir o desejado sinal de fluorescência. Uma gama de titulação típica é 1:100, 1:1000 e 1:10.000.
3. Deixe que as amostras à temperatura ambiente por até 10 minutos ou enquanto o slide está sendo preparada com agarose 1% em 1X médio Spizizens conforme descrito abaixo (veja o passo 1 de "preparação da lâmina").
4. Se a concentração de células é necessário, nós preferimos células filtragem utilizando um filtro de 0,2 m com um aparelho de vácuo. Células podem então ser lavada suavemente a partir da superfície do filtro com PBS, outro tampão apropriado ou médio antes de visualização.
Preparação de slides
1. Prepare agarose 1% com 1X Spizizens.
Adicionar 5 mL de estoque Spizizens 10X a 45 ml ddH2O juntamente com 0,5 g de agarose, e microondas para derreter. Hot agarose fundida é difícil de pipeta, e solidificou agarose não vai entrar na ponta da pipeta. A agarose deve ser equilibrada em banho-maria a uma temperatura de ~ 55-65 ° C para que entre a ponta da pipeta sem se solidificar dentro do ponta.
2. Desenhe 20 l de Spizizens com 1% de agarose derretida na ponta da pipeta. Pipetar uma gota (cerca de 1-2 mL) da solução de agarose em cada slide bem (nós usamos 15 slides bem, ver Tabela 2) para formar blocos de agarose rasas. A agarose solidifica imediatamente. Slides também deve ser feita imediatamente antes da aplicação das células. Se as almofadas de agarose são deixados à temperatura ambiente por si só, podem desidratar em minutos e se tornar inutilizável.
Almofadas de agarose deve ser centrado e preencha cada bem, mas tem altura mínima para evitar interromper as lamelas, se gotículas são muito altos (tipo bolha) ou se a amostra se espalha além do limite bem, passe simplesmente o limpa bem com um Kimwipe e aplicar um nova agarose pad.
3. Aplicar a amostra 300 mL inteira (consulte a etapa 6) para o slide, distribuídos na parte superior de cada bloco de agarose. Esta quantidade de células deve ser suficiente para cobrir cada bem no slide.
4. Permitir que o slide carregado com células a sentar-se à temperatura ambiente (23 ° C) por aproximadamente 10 minutos. Essa etapa permitirá que para as células a se estabelecer na almofada agarose tornando-se imóvel e pronto para geração de imagens. Para necessidades específicas esta temperatura pode ter de ser alterado, por exemplo, quando a realização de experimentos que requerem uma mudança de temperatura 4.
5. Aspirar o meio afastado o excesso de cada poço, sem retirar as almofadas si.
6. Aplicar a lamínula para o slide, pressionando com firmeza e de maneira uniforme, mas com cuidado, em toda a área do slide. Certifique-se que a lamínula é contra o slide e que a lamínula não é aumentado acima do slide.
Visualização de células
1. Muitos diferentes microscópios de fluorescência vai funcionar bem. É fundamental ter uma lente de imersão em óleo de 100X. O Laboratório de Simmons usa:
- Olympus BX61 equipado com microscópio de 1,45 TIRFM 100X óleo NA lente objetiva de imersão
- Hamamatsu ORCAR 2 CCD refrigerado câmera
- Lumen arco metálico 200 (prévia) fonte de luz.
- Para a detecção de GFP (FITC), excitação e emissão de filtro 460-500 510-560
- Para a detecção de FM4-64 (TRITC), filtro de excitação e emissão 510-560 572-648.
- As imagens foram capturadas SlideBook 4.2 (Figura 1)
2. Trazer as células para o foco usando luz branca.
3. Capturar a imagem usando filtros adequados para cada fluoróforo.
Resultados representante
Imagens representativas são mostradas (Figura 1). GFP focos devem ser bem definidos, enquanto FM4-64 coloração deve ser brilhante e claro 4-7. Imagens GFP ou membrana pode ser pseudo-colorida com qualquer cor, para permitir a imagem da mais alta qualidade a serem apresentados sem perder quaisquer dados.
Figura 1: Imagens GFP Representante do B. subtilis proteínas de fusão de translação. proteínas GFP são mostrados em verde, enquanto a coloração FM4-64 membrana é mostrado em vermelho. A barra de escala branca indica 3 mm (A) mutS-GFP [genótipo relevantes: mutS - gfp (SPC), amyE:: Pspac mutL (cat)]. Na presença de 600 mcg / mL 2 aminopurina e 1 mM IPTG. FM4-64 do sinal não é apresentada, a fim de mostrar mais claramente os focos mutS-GFP (B) MutL-GFP [genótipo relevantes: mutL:: mutL-GFP (spc)].. Na presença de 2-aminopurina (C) DNAX-GFP [genótipo relevantes: DNAX:: DNAX-GFP (spc)]. (D) RecA-GFP [genótipo relevantes: recA:: recA-GFP (spc)] na presença de 20 ng / mL mitomicina C. (E) TAGC-GFP genótipo [relevantes: TAGC:: TAGC-GFP (spc) ] na presença de 1 mg / mL mitomicina C.
| Tratamento / concentração ou quantidade | Função | Tempo de incubação |
| Mitomicina C (MMC) [20 e 150 ng / mL] | DNA agente alquilante | Uma hora |
| 2 aminopurina-(2-AP) [600 mcg / ml] | indução de incompatibilidade | Uma hora |
| Hidroxiureia (HU) | esgota dNTPs | 3 horas |
| luz ultravioleta (UV) 20 J/m2 | Timina-timina dímeros e 6-4 fotoprodutos | varia dependendo da fonte, geralmente 20 segundo |
| grays (radiação ionizante) 5 a 100 Gy | Dupla vertente quebra, rupturas dos filamentos simples e sites dano base | varia dependendo da fonte |
| Nome do reagente | Companhia | Número de catálogo | Comentários (opcional) |
| Multiteste slide, 15 bem | Biomedicals MP | 6041505E | |
| Tampa de vidro de microscópio | Pescador | 12-544-B | |
| Agarose | Pescador | BP160-500 | |
| Mitomicina C | Sigma | M0503-2mg | mutagênico, usar luvas |
| 2-aminopurina | Sigma | A3509-250mg | luvas |
| Hidroxiuréia | Sigma | H8627-25G | luvas |
| FM4-64 | Invitrogen | T13320 | sensível à luz |
Tabela 2. Lista de reagentes e equipamentos específicos:
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Discussion
Tentativa e erro são necessários para encontrar as condições de exposição de imagens da mais alta qualidade para cada cepa, e supomos que 1 milissegundo é apropriado para imagens com luz branca, enquanto exposições de 100 a 2000 ms são apropriados para GFP (FITC) e FM4-64 (TRITC ) imagens. Tempo de exposição vai variar dependendo do equipamento de imagem utilizada. Recomendamos o uso de uma cepa por 15 bem-lâmina de microscópio para a imagem mais simples, como a qualidade pad e difusão de células da fronteira pad pode complicar a diferenciação tensão se múltiplas cepas estão presentes no mesmo slide. A qualidade da imagem depende diretamente da qualidade do bloco de agarose onde as bactérias estão descansando. As imagens de alta qualidade será capturada a partir de agarose almofadas onde as bactérias estão lado a lado. Almofadas que fazem com que as células bacterianas moita, impedindo uma monocamada, produzirá imagens pobres. Almofadas que são muito espessas irá produzir um sinal de fundo de alta fluorescentes, quando as almofadas que são desidratadas não vai permitir que para as células para descansar adequadamente. Estes defeitos agarose pad normalmente irá resultar em qualidade de imagem muito pobre. Se um poço está produzindo imagens de fraca qualidade, basta mover para o próximo também. É ideal para capturar entre 50 e 200 células por imagem. Microscopia de fluorescência tem proporcionado uma riqueza de informações detalhando os sinais celulares que orientam a montagem de reparo de DNA e proteínas de replicação em focos in vivo. Com a prática, esta técnica pode ser aplicada com sucesso a uma variedade de complexos de proteínas em muitas espécies bacterianas.
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Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer as Dras. Philina S. Lee e Alan D. Grossman para a formação inicialmente LAS em microscopia de fluorescência. Os autores também agradecer as Dras. Melanie Berkmen e Hajime Kobayashi para a ajuda e dicas para a imagem latente. Este trabalho foi financiado por fundos start-up da Faculdade de Literatura, Ciência e Artes e do Departamento de Biologia Molecular, Celular e do Desenvolvimento na Universidade de Michigan.
Materials
| Specific solution recipes1: | |||
| 10x S750 salts 0.5 M MOPS 100 mM Ammonium Sulfate 50 mM Potassium Phosphate Monobasic Filter sterilize, and wrap S750 media in foil prior to storage |
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| 100x Metals 0.2 M MgCl2 70 mM CaCl2 5 mM MnCl2 0.1 mM ZnCl2 100 μg/mL Thiamine HCl 2 mM HCl 0.5 mM FeCl3* dH2O to final volume *FeCl3 should be added last, to prevent precipitation. After filter sterilization, wrap 100x Metal solution in foil. |
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| S750 media 1x S750 salts 1x Metal 1% Glucose 0.1% Glutamate 40 μg/mL Tryptophan 40 μg/mL Phenylalanine distilled H2O to final volume |
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| 10x Spizizens (grams/L) 151.4 mM Ammonium Sulfate (20g/L) 803.8 mM Potassium Phosphate Monobasic (140g/L) 440.9 mM Potassium Phosphate Dibasic (60g/L) 34.0 mM Sodium Citrate (10g/L) 16.6 mM MgSO4 (2g/L) dH2O to final volume Filter sterilize |
References
- Hardwood, C. R., Cutting, S. M. Molecular Biological Methods for Bacillus. , John Wiley and Sons. Chichester. (1990).
- Berkmen, M. B., Grossman, A. D. Spatial and temporal organization of the Bacillus subtilis replication cycle. Mol. Microbiol. 62, 57-71 (2006).
- Simmons, L. A., Grossman, A. D., Walker, G. C. Clp and Lon proteases occupy distinct subcellular positions in Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 190, 6758-6768 (2008).
- Simmons, L. A., Grossman, A. D., Walker, G. C. Replication is required for the RecA localization response to DNA damage in Bacillus subtilis. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 104, 1360-1365 (2007).
- Simmons, L. A., Davies, B. W., Grossman, A. D., Walker, G. C. b Clamp Directs Localization of Mismatch Repair in Bacillus subtilis. Mol. Cell. 29, 291-301 (2008).
- Simmons, L. A. Comparison of responses to double-strand breaks between Escherichia coli and Bacillus subtilis reveals different requirements for SOS induction. J. Bacteriol. 191, 1152-1161 (2009).
- Smith, B. T., Grossman, A. D., Walker, G. C. Visualization of mismatch repair in bacterial cells. Mol. Cell. 8, 1197-1206 (2001).
