Ventana en un micromundo: Sistemas sencillos de microfluidos para el estudio de transporte de microbios en medios porosos

Summary

Dispositivos de microfluídica se puede utilizar para visualizar procesos naturales complejos en tiempo real y en las escalas físicas adecuadas. Hemos desarrollado un sencillo dispositivo de microfluidos que imita las características clave de los medios porosos naturales para el estudio del crecimiento y el transporte de bacterias en el subsuelo.

Abstract

El crecimiento microbiano y transporte en medios porosos tienen implicaciones importantes para la calidad de aguas subterráneas y superficiales, el reciclaje de nutrientes en el medio ambiente, así como directamente por la transmisión de patógenos a los suministros de agua potable. Natural de medios porosos se compone de una topología compleja física, química variada superficie, gradientes de dinámica de nutrientes y aceptores de electrones, y una distribución irregular de los microbios. Estas características varían sustancialmente en una escala de longitud de micras, por lo que los resultados de la macro-escala de las investigaciones del transporte de microbios difíciles de interpretar, y desafiando a la validación de los modelos mecanicistas. Aquí se demuestra lo simple que los dispositivos de microfluidos se puede utilizar para visualizar las interacciones microbianas con micro-hábitats estructurados, para identificar los procesos clave que influyen en los fenómenos observados, y para validar modelos predictivos de forma sistemática. Simple, fácil de usar células de flujo se construye a partir de la transparencia, material biocompatible y permeable al oxígeno-poli (dimetil siloxano). Los métodos estándar de fotolitografía se utiliza para hacer micro-estructura maestros, y el moldeado de réplica se utiliza para convertir células de micro-estructura del flujo de los maestros. El diseño físico de la cámara de la celda de flujo es adaptable a los requerimientos experimentales: microcanales puede variar desde una simple conexión lineal con topologías complejas con tamaños tan pequeños como de 2 micras. Nuestro flujo de modular ECOCHIP matriz de células características de docenas de cámaras idénticas y control de flujo mediante un módulo de flujo por gravedad-impulsado. Se demuestra que a través del uso de dispositivos de ECOCHIP, estructuras físicas y las cabezas de presión puede mantenerse constante o variar sistemáticamente, mientras que la influencia de la química de superficie, las propiedades del fluido, o las características de la población microbiana que se investiga. A través de experimentos de transporte con una no patógena, la proteína verde fluorescente que expresan

Protocol

I. fabricación de dispositivos de microfluídica

1. El primer paso en la creación de un dispositivo de microfluidos es dibujar un diseño en dos dimensiones del dispositivo en un equipo de dibujo asistido (CAD). Hemos utilizado AutoCAD, pero otros programas de dibujo también están disponibles, tales como CleWin o CorelDraw.
2. El siguiente paso es fabricar una máscara de fotolitografía. Dependiendo de las dimensiones del dispositivo, requiere la resolución y el presupuesto, estas máscaras pueden ser fabricados en cromo (la más alta resolución, alto costo), creado sobre una película fotográfica, o incluso imprimir directamente en una transparencia con una impresora de alta resolución. Aquí, hemos utilizado máscaras Cr. fabricado por adelantado Reproducciones Corp., North Andover, MA.
3. El siguiente paso es transferir el patrón de la máscara en un epoxi fotosensible para crear un molde en relieve de socorro.
   1. En primer lugar, una capa fotosensible de SU8 negativa se hace girar sobre una oblea de silicona para el espesor deseado, y al horno para volatilizar el exceso de solvente. Fotosensible velocidades formulación y girar el control del espesor de la capa depositada.
   2. Entonces, el patrón está expuesto a una dosis pre-determinada de luz ultravioleta a través de la máscara. A después de la exposición hornear enlaces cruzados de las regiones expuestas a la luz de la capa fotosensible, los hace insolubles.
   3. Lo siguiente es la etapa de desarrollo, donde no expuestos resistir se retira con un desarrollador de productos químicos, dejando un positivo elevado de alivio estructura llamada un maestro.
   4. Una tercera etapa de cocción llamado duro paso hornear es opcional para fijar aún más las estructuras.
4. PDMS moldeo
   1. Usamos el elastómero de silicona de poli (dimetil siloxano) para el moldeo por réplica de dispositivos de microfluídica ^1. En primer lugar, la materia prima se mezcla en una proporción de 10:1 con el agente de curado, se vierte sobre el molde en un recipiente poco profundo, como una placa de Petri, y desgasificado al vacío hasta que todas las burbujas visibles se han ido.
   2. El maestro con el PDMS sin curar se coloca en un horno cuidadosamente nivelada por lo menos durante 4 horas a 65 ° C para la reticulación del polímero que se produzca.
   3. Después de PDMS se solidifica, la sección de moldeado se corta de la placa de Petri. Los agujeros son perforados a través de la parte superior del dispositivo para acceder a los espacios de microfluidos en el dispositivo terminado.
5. Adjunto al vidrio
   1. Limpie PDMS es irreversible en condiciones de servidumbre a limpiar el cristal por la exposición al plasma de oxígeno. En primer lugar, el moldeado y puñetazos PDMS y un portaobjetos de vidrio limpio se colocan en la superficie de adhesión a un limpiador de plasma. Se utilizó un PDC-32G Harrick limpiador de plasma.
   2. Después de que la cámara está cerrada, el operador se convierte en una bomba de vacío y la frecuencia de radio o de la fuente de RF. Plasma auto se enciende en la cámara, como lo demuestra un brillo ligeramente púrpura en la cámara.
   3. Después de la exposición al plasma durante 30 segundos, la fuente de RF y la bomba de vacío se apagan.
   4. Rápidamente, los portaobjetos de vidrio y un dispositivo de PDMS se retiran de la cámara y en contacto directo (lado moldeado PDMS superficie hacia abajo). Esto forma una unión irreversible, y también hará que las propiedades de superficie hidrófila.
   5. Si lo desea, químicas diferentes de la superficie se puede lograr con PDMS con la inmovilización de proteínas en la superficie por adsorción o enlaces covalentes.
   6. El dispositivo puede ser llenado con líquidos tales como agua desionizada, medios de cultivo, o artificial de aguas subterráneas por las fuerzas capilares o el uso de una presión suave con una jeringa.

II. La cuantificación de flujo de dispositivo de microfluidos por análisis gravimétrico

1. Para calibrar la presión impulsada por el flujo en el dispositivo, la micro-estructura de flujo de células fueron cargados primero con agua DI.
2. Un depósito de líquido que contiene, como una jeringa de plástico o el módulo de flujo (Figura 1) está conectado a la entrada de aguas arriba, así, y la altura del líquido en el depósito se mantiene por encima de la altura a la corriente abajo también.
3. Las muestras se recogen en los residuos y, a intervalos regulares y se pesa en una balanza analítica.
4. La pendiente de la curva de trazado volumen total frente al tiempo total da la tasa de flujo volumétrico promedio (Figura 2). Hemos encontrado velocidades reproducible y lineal promedio para una amplia gama de cabezales de presión y para mantener la presión de diferentes sistemas.

III. La visualización de flujo, un mapa de velocidad, y la interacción hidrofílica / hidrofóbica

1. Para la calibración del modelo, 3 micras perlas fluorescentes de látex en ambas superficies carboxílicos YG YG y la llanura fueron adquiridos de Polysciences, Inc. y se diluyeron en agua DI a la concentración de sólidos en un 0,01%.
2. Cuentas que fluye a través de los hábitats se visualizaron en un Zeiss Axiovert 25 microscopio de fluorescencia equipado con un Mightex BCE-B013-U cámara monocromática.
3. Imágenes individuales fueron capturados en una rápida sucesión y montados en películas con el paquete de software ImageJ (Figura 3).

IV. Dispositivo de microfluidos (ECOCHIP) para el modelado el crecimiento bacteriano y de transporte

1. Vibrio sp. GFP Kan, una no patógena la proteína verde fluorescente que expresan organismo se cultivó durante 14 horas en medio Luria-Bertani a una concentración de aproximadamente 10 ⁹ células / ml.
2. Las bacterias en el medio de cultivo se introdujeron en dispositivos ECOCHIP y permitió a colonizar el dispositivo y establecer flóculos y películas durante la noche durante 19 horas.
3. A continuación, los medios de cultivo fue retirado de los pozos y todos los hábitats se lavaron con agua de mar artificial (ver Wang et al. ² por receta ASW) para que las diferentes densidades de bacterias que permanecen en los diferentes hábitats.
4. Un hábitat se mantuvo sellado con ausencia de flujo, mientras que las condiciones de flujo lento se mantuvo en el 3 otros hábitats.
5. Imágenes de luz fluorescente y blanco del crecimiento bacteriano se tomaron cada 15-20 horas durante un período de varios días (Figura 4).

V. Los resultados representativos

El módulo de flujo proporciona medios simples para la regulación y distribución de los flujos a través de múltiples hábitats. Gravimétricos de análisis resultó ser una manera fácil y sencilla para determinar las tasas de flujo a través de las estructuras de hábitat, que dependen de la resistencia hidráulica de los hábitats y las diferencias de presión entre la entrada y salida de los pozos. Para los experimentos de flujo de grano se ha observado acumulación mucho más grande de cuentas en las superficies del dispositivo para las cuentas uncarboxylated (Figura 2). Además, los granos más grandes de diámetro, 6 y 10 mm, eran mucho más propensos a ser arrastrados en las aberturas de los poros más pequeños y comienzan a acumularse en el dispositivo. Mayor velocidad de flujo reducido de retención de partículas y el arrastre.

Durante los experimentos de crecimiento de las bacterias, la influencia de las condiciones de flujo es claramente evidente. Las fuerzas de corte continuo hace que las bacterias agregadas juntos y flóculos forma, y ​​que no se encuentra en las células individuales. El transporte de grandes flóculos bacterianos es un proceso importante del medio ambiente que es extremadamente difícil de estudiar en un sistema macroscópico.

Figura 1. Esquema que muestra las características y el funcionamiento del módulo de flujo.

Figura 2. Tasa de flujo a través del hábitat estructurado según lo determinado por análisis gravimétrico para alturas de columna diferente. Relación de Altura de la columna: 60 / 40 = 1.5, flujo de determinar la razón de tasas: 1,04 / 0,71 = 1,46. Como resultado tasas de flujo de H = 40 mm es V = 0,71 l / min y para H = 60 mm es V = 1,04 μ L / min. Estima que la velocidad lineal promedio de 3,1 mm / s, y 4,6 mm / s, respectivamente.

Figura 3. Transporte de 3um bolas de látex con y sin carboxilación fluye a través de los hábitats estructurados.

Figura 4. Cambio en el crecimiento de bacterias y la formación de biofilm en función de la densidad de semillas en presencia de un flujo lento.

Discussion

El sistema ECOCHIP es adaptable a las necesidades de un experimento individual. Maestros se pueden crear nuevos con relativa facilidad, y una vez que un maestro se fabrica, otros dispositivos exactamente replicado se puede lanzar si es necesario. El módulo de flujo es fácil de usar, no requiere ningún equipo especial ni conexiones complejas, y puede ser modelado como una simple de la cabeza caída de presión impulsada por sistema de flujo. Extensiones adicionales para este trabajo están en curso, e incluyen la creación de canales revestidos de ácidos húmicos y sistemáticamente la variación de la química acuosa del fluido. Con este enfoque, las interacciones micro-escala de las bacterias con superficies y los fenómenos de crecimiento y de transporte en medios porosos puede ser observada directamente y sistemáticamente investigados.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
PDMS	Dow Corning
SU8-2025	MicroChem Corp.
Fluorescent Beads	Polysciences, Inc.