Summary
Микрожидкостных устройств могут быть использованы для визуализации сложных природных процессов в режиме реального времени и соответствующие физические масштабы. Мы разработали простую микрожидкостных устройство, которое имитирует ключевые особенности природных пористых средах для изучения роста и транспортировки бактерий в подземных.
Abstract
Микробная роста и транспорта в пористых средах иметь важные последствия для качества грунтовых и поверхностных вод, утилизации питательных веществ в окружающую среду, а также непосредственно для передачи патогенов к питьевой воде. Природные пористые среды состоит из сложной физической топологии, разнообразная химия поверхности, динамические градиенты питательных веществ и акцепторов электронов и неоднородное распределение микробов. Эти особенности существенно различаются на масштабе микрон, что делает результаты макромасштабе исследования микробных транспорта трудно интерпретировать, и проверка механистической модели сложной задачей. Здесь показано, как простые микрожидкостных устройств могут быть использованы для визуализации микробных взаимодействий с микро-структурированных сред обитания, определить ключевые процессы, влияющие на наблюдаемые явления, а также систематически проверки прогностических моделей. Простой, легкий в использовании клетки потока были построены из прозрачных, биосовместимых и кислородно-проницаемого материала поли (диметил силоксан). Стандартные методы фотолитографии были использованы для микро-структурированных мастеров, и реплики литья была использована, чтобы бросить микро-структурированных клетках поток от мастеров. Физическое проектирование камеры проточной кюветы может адаптироваться к экспериментальным требования: микроканалов может варьироваться от простого линейного соединения сложных топологий с функцией размером до 2 мкм. Наши модульные EcoChip поток массив ячеек представлены десятки идентичных камер и управление потоком по тяжести управляемой потоком модуля. Мы показываем, что за счет использования устройств EcoChip, физических структур и давление головки могут быть постоянными или разнообразные систематически в то время как влияние химии поверхности, свойства жидкости, или характеристики микробного населения исследуется. Через транспортные эксперименты с использованием непатогенных, зеленый флуоресцентный белок, экспрессирующих
Protocol
И. микрожидкостных устройств Изготовление
- Первым шагом в создании микрожидкостных устройств является привлечение двумерной расположение устройства в компьютер помогает рисование (CAD) программ. Мы использовали AutoCAD, но и других графических программах, также доступны, такие как CleWin или CorelDraw.
- Следующий шаг заключается в изготовлении фотолитографии маску. В зависимости от устройства размеры, необходимые разрешения и бюджета, эти маски могут быть изготовлены в хром (высокое разрешение, высокая стоимость), созданный на фотопленку или даже печатать непосредственно на накладные прозрачности с использованием принтер высокого разрешения. Здесь мы использовали Cr маски производства Advance Репродукции корпорации, Северной Андовер, штат Массачусетс.
- Следующим шагом является передача картины от маску на светочувствительной эпоксидной создать подняли сброса формы.
- Во-первых, слой фоторезиста отрицательные SU8 вращается на силиконовых пластин до требуемой толщины, и запеченные для испарения избыточной растворителя. Фоторезист разработке и спина скоростях контроль толщины осажденного слоя.
- Затем шаблон подвергается заранее определенной дозы УФ-света через маску. Постконтактной запекать перекрестные ссылки свете, подвергшихся воздействию районов фоторезиста покрытием, что делает их неразрешимыми.
- Далее идет развитие шаг, где неэкспонированные сопротивляться удаляется с химическими разработчиков, оставляя положительные подняли сброса структуру, называемую мастера.
- Третий этап выпечки называют жестким шагом выпекать не является обязательным для дальнейшего исправления структуры.
- PDMS литье
- Мы используем силиконового эластомера поли (диметил силоксан) для реплики формования микрожидкостных устройств 1. Во-первых, основной материал смешивается в 10:01 весу с отвердителем, облили плесени в мелкий контейнер, такой как чашке Петри, а при их дегазации с вакуумным пока все видимые пузырьки исчезли.
- Мастер с неотвержденного PDMS затем помещается в печь тщательно выровнена, по крайней мере 4 часа при температуре 65 ° С для сшивания полимера, чтобы произойти.
- После PDMS затвердевает, формованные разделе вырезается из чашке Петри. Отверстия пробиваются через верхнюю часть устройства для доступа к микрожидкостных пространства в готовом устройстве.
- Привязанность к стекла
- Чистая PDMS необратимо связана с чистой стекла под воздействием кислородной плазмы. Во-первых, литой и ударил PDMS и чистой предметное стекло помещают связи поверхностью вверх в плазме чище. Мы использовали PDC-32G Harrick плазмы чище.
- После закрытия камеры, оператор включается вакуумный насос, а затем радиочастоты или ВЧ источника. Плазменные будет самостоятельно зажечь в камере, о чем свидетельствует слегка фиолетовым свечением в камере.
- После контакта с плазмой в течение 30 секунд, ВЧ источника, а затем вакуумный насос отключается.
- Быстро, предметное стекло и PDMS устройства удаляются из камеры и привел в непосредственном контакте (формованные PDMS боковой поверхностью вниз). Это сформирует необратимые связи, а также сделает свойств поверхности гидрофильной.
- При желании, различных химических поверхности может быть достигнуто с PDMS путем иммобилизации белков на поверхности путем адсорбции или ковалентные связи.
- Устройство может быть заполнен жидкостью, такие как деионизированной воды, питательных сред, или искусственных подземных вод капиллярные силы или ее применения как мягкое давление с помощью шприца.
II. Поток Количественная микрожидкостных устройств путем гравиметрического анализа
- Для калибровки давления управляемых потоков в устройстве, микро-структурированных клетках поток впервые с предустановленной воды DI.
- Жидкости, содержащей водохранилища, такие как пластиковый шприц или потока модуля (рис. 1) подключается к вышестоящему входе хорошо, и высота жидкости в резервуаре поддерживается выше высоты вниз по течению хорошо.
- Образцы, собранные на отходы и через регулярные промежутки времени и взвешивали на аналитических весах.
- Наклон кривой построения общего объема против общего времени дает средний объемный расход (рис. 2). Мы обнаружили, воспроизводимые, линейные средние скорости для широкого круга руководителей и давление для различных поддержания давления системы.
III. Визуализация потока, скорость карт, а также Гидрофильные / гидрофобные взаимодействия
- Для калибровки модели, 3 мкм люминесцентные бусины латекса в обоих Карбокси Ю. и Ю. Г. Обычная поверхность были приобретены у Polysciences, Inc и разводили в воде DI с концентрацией 0,01% твердых веществ.
- Бисер, протекающий через места обитания были визуализированы на Zeiss Axiovert 25 флуоресцентный микроскоп оснащен Mightex до н.э.-B013-U монохромные камеры.
- Отдельные кадры были захвачены в быстрой последовательности и собраны в кино вместе с пакетом программного обеспечения ImageJ (рис. 3).
IV. Микрожидкостных устройств (EcoChip) для моделирования роста бактерий и транспорта
- Vibrio зр. GFP Кан, непатогенные зеленый флуоресцентный белок, экспрессирующих организм был выращен в течение 14 часов в Лурия-Бертани средней концентрацией около 10 9 клеток / мл.
- Бактерии в ростовую среду были введены в устройствах EcoChip и позволили, чтобы колонизировать устройство и установить хлопьев и фильмы ночь в течение 19 часов.
- Затем рост средств массовой информации была удалена из скважин, и все места обитания были сброшены с искусственной морской водой (см. Wang и соавт. 2 для рецепта ASW), так что разные плотности бактерий, оставшихся в различных местообитаниях.
- Один обитания хранился запечатанный, не поток, в то время как медленный поток условия поддерживались в 3 других мест обитания.
- Флуоресцентные и белый свет фотографии роста бактерий были взяты каждые 15-20 часов в течение нескольких дней (рис. 4).
Результаты В. представитель
Поток модуль обеспечивает простое средство для регулирования и распределения потоков через множество сред обитания. Гравиметрический анализ оказался легким и простым способом, чтобы определить скорость потока через обитания структур, которые зависят от гидравлического сопротивления среды обитания и перепадов давления между входом и выходом скважины. Для бусинка экспериментов потока мы наблюдали гораздо больше, бусинка накопления на поверхности устройства для uncarboxylated шариков (рис. 2). Кроме того, больший диаметр бусин, 6 и 10 мм, было гораздо больше шансов стать вовлеченного в меньшие отверстия поры и начинают накапливаться в устройстве. Более высокая скорость потока снижается удержания частиц и увлечения.
Во время экспериментов бактерии роста, влияние потока условиях очевидной. Непрерывные усилия сдвига причиной бактерии для объединения вместе и образуют хлопья, и следует искать не в виде отдельных клеток. Транспорт большого бактериальных хлопьев является важным экологическим процессом, который очень трудно учиться в макроскопической системы.
Рисунок 1. Схематическое изображение функции и операции потока модуля.
Рисунок 2. Расход через структурированную среду обитания, как это определено гравиметрического анализа для различных высот столбцов. Колонка высотой соотношение: 60 / 40 = 1,5, определяется отношением скорости потока: 1,04 / 0,71 = 1,46. Приведенные расхода для H = 40 мм, V = 0,71 мкл / мин, а для Н = 60 мм, V = 1,04 μ л / мин. Расчетная средняя линейная скорости 3,1 мм / с и 4,6 мм / с соответственно.
Рисунок 3. Перевозка 3УМ бисером латекса с и без карбоксилирования, протекающий через структурированных сред обитания.
Рисунок 4. Изменение бактериального роста и образования биопленки в зависимости от плотности семян в присутствии медленного течения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Система EcoChip является адаптируемой к потребностям отдельного эксперимента. Новые мастера могут быть созданы относительно легко, и как только мастера изготавливают, дополнительные точно репликации устройства могут быть поданы по мере необходимости. Поток модуль прост в использовании, не требует специального оборудования или сложных соединений, и может быть смоделирована как простое падение напора система, управляемая потоком. Дополнительные расширения для этой работы продолжаются, и включают в себя создание гуминовых кислот покрытием каналов, и систематически различной водной химии течет жидкость. Используя этот подход, микро-вертикальные взаимодействия бактерий с поверхности и роста и явлений переноса в пористых средах можно наблюдать непосредственно и систематически исследованы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано грантом # 0649883 от Национального научного фонда, по Vanderbilt Институт интегративной Biosystems исследований и образования (VIIBRE), а по биологии Серл системы и биоинженерии Бакалавриат Опыт исследований (Searle SyBBURE).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PDMS | Dow Corning | ||
| SU8-2025 | MicroChem Corp. | ||
| Fluorescent Beads | Polysciences, Inc. |
References
- Whitesides, G., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. Soft lithography in biology and biochemistry. Annual Review of Biomedical Engineering. 3, 335-373 (2001).
- Wang, W., Shor, L. M., LeBoeuf, E. J., Wikswo, J. P., Kosson, D. S. Mobility of protozoa through narrow channels. Applied and Environmental Microbiology. 71, 4628-4637 (2005).
