Summary
微流体装置，可用于可视化实时和复杂的自然过程，在适当的物理尺度。我们已经开发出一种简单的微流体装置，模仿天然多孔介质的主要特点，为研究细菌的生长和运输在地下。
Abstract
多孔介质中微生物的生长和运输地下水和地表水，营养物质在环境中的回收利用，以及直接用于饮用水供应的病原体的传播质量有重要影响。天然多孔介质是一个复杂的物理拓扑结构，各种不同的表面化学，营养物质和电子受体的动态梯度，和片状分布的微生物组成。超过一个微米尺度，这些功能有很大的差别，使微生物的运输难以解释的宏观尺度的调查结果，并具有挑战性的机理模型验证。在这里，我们演示了如何简单的微流体装置，可用于可视化微生物的相互作用与微结构的栖息地，影响观察到的现象，以确定关键工序，和系统验证预测模型。构造简单，易于使用的流动细胞透明，生物相容性和氧气的渗透性材料聚（二甲基硅氧烷）。标准的光刻方法被用来制造微结构的主人，和副本成型用于铸造微结构的流动细胞的主人。流动池室的物理设计是适应实验的要求：微可以有所不同，从简单的线性连接复杂的拓扑结构与功能的大小为2微米的小。我们的模块化EcoChip流单元阵列，几十种功能相同的商会和流量控制由重力驱动流模块。我们展示通过EcoChip设备的使用，物理结构和压头可保持不变或更改系统而影响表面化学，流体性质，或微生物群的特点是调查。通过运输，使用非致病性的实验，绿色荧光蛋白表达
Protocol
一，微流体设备制造
- 在创建一个微流体装置的第一步是绘制两个设备的立体布局，在电脑辅助绘图（CAD）程序。我们已经使用AutoCAD，但也可用其他绘图程序，如CleWin或CorelDRAW。
- 下一步是要编造光刻用掩模。器件尺寸的不同，所需的分辨率和预算，这些面具可能是捏造的铬（分辨率最高的，成本高），在感光胶片上创建，甚至开销的透明度，使用高分辨率的打印机上直接打印。在这里，我们使用了由高级复制品公司，北安多弗，马生产的铬口罩。
- 下一步是将其转移到一个光敏环氧创建一个提出救济模具从面具的格局。
- 首先，负SU8光刻胶层剥离到一个硅晶片所需的厚度，和烤挥发多余的溶剂。光致抗蚀剂的配方和转速控制的沉积层的厚度。
- 然后，该模式是接触到一个预先确定的剂量紫外线光通过掩膜的。烘烤后曝光交叉连接的光致抗蚀剂涂层的光暴露的地区，使其不溶性。
- 接下来是一步的发展，其中未曝光的抵制是一种化学品开发中删除，留下一个积极筹集救灾的结构称为主。
- 第三烘焙步骤，称为硬烤步骤是可选的进一步修复的结构。
- 硅橡胶成型
- 我们使用有机硅弹性体聚（二甲基硅氧烷）微流体装置1副本成型。首先，基体材料是在与固化剂，在模具中倒入一个浅的容器，如培养皿的重量比10:1混合，真空脱气，直到所有可见的气泡都没有了。
- 固化硅橡胶的主4H至少在一个精心夷为平地的烤箱，然后放置在65 ° C交叉连接的聚合物发生。
- PDMS固化后，模压部分切出的培养皿。孔打孔通过设备的访问在完成设备的微流体空间的顶部。
- 附件玻璃
- 清洁PDMS造成不可挽回的保税接触氧等离子体清洁玻璃。首先，的成型和冲压的PDMS和一个干净的载玻片置于粘接面成等离子清洁。我们使用的PDC - 32G Harrick等离子清洁。
- 后室是封闭的，运营商将在真空泵，然后无线电频率或射频源。等离子将自行点燃室，一个略带紫色的光芒，在会议厅内证明。
- 曝光后30秒，等离子，射频信号源，然后真空泵关闭。
- 快速，载玻片和PDMS设备是从会议厅中删除，并带来直接接触（成型的硅橡胶表面的一面朝下）。这将形成一个不可逆转的债券，还将使亲水性的表面性质。
- 如果需要，可实现不同的表面化学，通过固定的蛋白质表面吸附或共价键与硅橡胶。
- 该设备可以被充满液体为去离子水，生长介质，或由毛细管力或用注射器使用温和的压力地下水人工等。
二。流微流控芯片的量化重分析
- 为了校准设备中的压力驱动流，微结构的流动细胞首先预装离子水。
- 一个液体含有水库，如塑料注射器或流量控制模块，（如图1所示）是连接到上游入口好，水库中的流体高度以上的高度以及在下游保持。
- 样品废物收集和定期分析天平权衡。
- 绘图总量与总时间曲线的斜率给出的平均体积流率（图2）。我们发现，重现性好，广泛的压头和不同的压力，维护系统的非线性平均速度。
三。流程可视化，速度映射和亲水/疏水
- 模型校准，3微米的两个羧基永贵和平原永贵表面荧光乳胶珠被收购公司Polysciences，DI水稀释至0.01％的固体浓度。
- 珠流经的栖息地，一个ZEISS AXIOVERT 25荧光显微镜配备一个Mightex公元前- B013 - U单色相机上的可视化。
- 单个帧快速连续被抓获，并组装成电影与ImageJ软件程序包（图3）。
四。建模细菌的生长和运输的微流体装置（EcoChip）
- 弧菌 。 GFP侃，一个非致病性的绿色荧光蛋白表达生物体生长到约10 9细胞/毫升的浓度为14小时卢里亚- Bertani培养基。
- 细菌在培养基中被引入EcoChip设备，并允许殖民化设备，建立19小时通宵的絮体和电影。
- 生长介质从水井中删除所有的栖息地被刷新人工海水（ASW的配方，请参阅王等。），使不同密度的细菌在不同的栖息地的剩余。
- 一个栖息地保持密封，无流量，而在其他栖息地维持血流缓慢的条件。
- 细菌生长的荧光和白光照片拍摄了数天（图4）期间每隔15-20小时。
五，代表性的成果
流量控制模块提供了简单的方法，通过多种栖息地的管理和分发流动。重量分析被证明是一个简单易懂的方法来确定的流速通过栖息地的结构，它的栖息地和输入和输出口井之间的压力差的液压阻力取决于。对于珠流实验中，我们所观察到uncarboxylated珠（图2）的设备表面珠积累大得多。此外，直径较大的珠子，6日和10毫米，更可能成为较小的孔开口夹带设备，并开始积累。更快的流速降低颗粒保留和夹带。
在细菌的生长实验，水流条件的影响是显而易见的。连续剪切力会导致细菌聚集在一起，形成絮体，而不是作为单个细胞中发现。大量细菌絮凝物的运输是一个重要的环境的过程，是极难在一个宏观的系统研究。
图1原理图的显示功能和操作流模块。
图2：通过结构化的栖息地。流率，重量不同的列的高度分析确定。柱高度的比例：60 / 40 = 1.5，确定流量比率：1.04 / 0.71 = 1.46。为H = 40毫米，致使流速为V = 0.71微升/分钟，为H = 60毫米为V = 1.04μL / min的。估计平均线速度3.1 mm / s和4.6毫米/秒。
图3。运输与不通过结构化的栖息地流淌羧3um乳胶珠。
图4。细菌生长和生物膜形成的种子密度函数在一个缓慢的流动存在的变化。
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Discussion
EcoChip系统是适应个别实验的需要。可以比较容易地创建新主人，并且一次主人是捏造的，可以转换为需要额外的精确复制的设备。流量控制模块是使用简单，不需要特殊的设备或复杂的连接，并可以作为一个简单的下降头部压力驱动流系统建模。额外的扩展这项工作正在进行中，包括创建腐殖酸涂层的渠道，系统不同的流体流动的水化学。使用这种方法，细菌的微观尺度的表面和多孔介质中的生长和运输现象的相互作用，可直接观察和系统研究。
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Acknowledgments
支持这项研究是从通过结合生物研究和教育（VIIBRE）范德比尔特研究所，美国国家科学基金会和塞尔系统生物学和生物工程本科研究经验（塞尔SyBBURE）授予＃0649883。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PDMS | Dow Corning | ||
| SU8-2025 | MicroChem Corp. | ||
| Fluorescent Beads | Polysciences, Inc. |
References
- Whitesides, G., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. Soft lithography in biology and biochemistry. Annual Review of Biomedical Engineering. 3, 335-373 (2001).
- Wang, W., Shor, L. M., LeBoeuf, E. J., Wikswo, J. P., Kosson, D. S. Mobility of protozoa through narrow channels. Applied and Environmental Microbiology. 71, 4628-4637 (2005).
