Summary
プロトコルは、メチロトローフ酵母を用いたタンパク質の発現を説明します
Abstract
微生物、真核宿主ピキアパストリスのタンパク質発現は、高速で使いやすい発現系で組換えタンパク質を大量に生成する可能性を提供しています。
単細胞微生物P.としてピキアパストリスは、操作が容易であり、高い細胞密度で安価なメディアに急速に成長する。真核生物、P.ビーイングピキアパストリスは、高等真核細胞および得られた組換えタンパク質によって行われる翻訳後修飾の多くは、タンパク質フォールディング、タンパク質分解処理、ジスルフィド結合形成、グリコシル化[1]を受け実行することができます。
メチロトローフ酵母P.としてピキアパストリスは、その唯一の炭素源としてメタノールを代謝することが可能です。アルコールオキシダーゼ、AOX1、のための強力なプロモーターは、厳重に規制されているとメタノールで誘導し、それが目的の遺伝子の発現のために使用されています。したがって、外来タンパク質の発現は、増殖培地にメタノールを添加することにより誘導することができる[2、3]。
もう一つの重要な利点は、P.パストリスの分泌経路に外来タンパク質を標的とするシグナル配列を使用して、増殖培地中への組換えタンパク質の分泌です。酵母自体がメディアに分泌される内因性のタンパク質やメディアにない追加のタンパク質だけ低いレベルで、異種蛋白質は培地中の全タンパク質の大部分を構築し、タンパク質の精製の手順に従って容易に[3、4]。
（pPICZαA）ここで用いられるベクターは、目的の遺伝子の厳密に調整、メタノール誘導発現のためのAOX1プロモーターを含み、組換えタンパク質の分泌のためのα-因子分泌シグナル、両方E.で選択ゼオシン耐性遺伝子を大腸菌およびピキアおよび c - mycエピトープと組換えタンパク質の検出および精製の ためのポリヒスチジン（6 ×）タグを含むC末端ペプチド。我々はまた、親のベクトル上のc - mycのエピトープを認識する特定の抗 myc - HRP抗体を用いた組換えタンパク質のウェスタンブロット分析を示す。
Protocol
メチロトローフ酵母 Pichia pastorisにおける組換えタンパク質の発現
このプロトコルを開始する前に、P.フレームでクローニングされた目的の遺伝子を持つ必要がありますそれは、ベクトルで、目的の遺伝子の正しい挿入を確認するためにパストリス親ベクトルと配列を決定している。
ステップI：、P.への構築と変形の線形化をエレクトロ酵母細胞の生成ピキアパストリス
このステップでは、手で次のようにメディアとプレートを持っている必要があります。
- YPDSプレート
- 600mLのYPD培地
- 氷冷滅菌水
- 1Mソルビトール
- アミコンウルトラ-4遠心フィルターデバイス
- マイクロコンYM - 30遠心フィルターユニット
- 0.2センチメートルエレクトロポレーションキュベット
- 15 mLの滅菌ガラス管
- 滅菌ガラスパスツールピペット
- ゼオシンを含むYPDSプレート
第1部：エレクトロ酵母細胞の調製
- 四日前にP.て目的の変換のストリークパストリスゼオシンなしYPDSプレート上の細胞と、それらは1〜2日または単一のコロニーが形成されるまで30℃を成長させることができます。
- 意図した変換前の二日間は、P. 5 mlを拡大30で50 mlのFalconチューブのYPD培地でパストリス菌株℃で一晩。シェーカーでそれを修正するためにフラスコにファルコンチューブを置きます。
- 0.25一晩培養物の添加および30℃シェーカーで一晩、再び成長させ° CをOD 600 = 1.3から1.5に2リットルのフラスコで、新鮮なYPD培地の変換接種500mLの前日。
注：あなたが正確な結果を得るように分光光度計で測定する前にサンプルを希釈する。 - 変革の日は、氷冷滅菌水と手で1Mソルビトールを持っている。 4℃で5分間1500 × gで細胞を遠心℃に氷のように冷たい、滅菌水500mLでペレットを再懸濁します。
- ステップ4として再度細胞を遠心分離します。氷のように冷たい、滅菌水250 mLでペレットを再懸濁します。
- ステップ4と同様に、再度細胞を遠心分離します。ソルビトール氷冷した1 M 20mLにペレットを再懸濁する。
- ステップ4と同様に、再度細胞を遠心分離します。 〜1.5 mLの最終容量にソルビトール氷冷した1 M 1mL中にペレットを再懸濁する。氷上もしくは4℃でさらに使用するまでストア細胞。
注：我々は必要以上のエレクトロコンピテント細胞を準備し、-80マイクロ遠心チューブに80μlのアリコートに保管℃に我々は、もはや1カ月保存した電池を使用。
パート2：pPICZαA構造の線形化と集中
形質転換のために制限消化によって目的遺伝子を含むベクトルを線形化する。我々は、酵素PmeIを使用してください。他の制限部位が可能です。あなたの挿入があなたのベクトルを線形化するために使用する制限部位を含んでいないことを確認する必要があります。 P.に変換するためピキアパストリスでは5〜10μlの滅菌水で線状化DNAの5〜20μgのが必要になります。
また、線形集中とP.にプレーンベクトル（NO INSERT）を転送するピキアパストリス 。インサートのない親のベクトルは、バックグラウンド細胞内発現のための制御であり、あなたの式の結果を解釈することができます。
- 氷の上のすべての試薬を解凍、以下の試薬を組み合わせて、簡単に、底にすべての液体を得るためにチューブを遠心チューブをタップして、再度スピン。
- Xμlの滅菌水
- 5.0μL10X NEBuffer 4
- 0.5μL100X BSA
- 最大2μgのベクターDNA（〜は100 ng /μL）に
- 2.0μLPME I酵素ミックス
注：別のチューブに上記のミックスを3または4回準備し、アミコンウルトラ遠心装置を経由して消化されたDNAを濃縮する際のソリューションを組み合わせて十分な線状化ベクターのDNAを得るために。 - 3時間と熱が20分間65℃で酵素ミックスを不活性化° Cは、37でインキュベートする。
- 平均時間Milli - Q水を1mLとプレリンスアミコンウルトラ-4遠心フィルターデバイスでは、6-8分、4000 × gでチューブをスピンし、フロースルーを捨てる。
メモ：メンブレンがかつてウェットを乾燥させないでください。事前に洗浄した後、デバイスを使用していない場合、デバイスが使用されるまで、膜に水を残す。 - プレリンスアミコン遠心フィルターユニットにステップ2からの熱不活性化ソリューションを転送、6-8分、4000 × gでチューブをスピンし、フロースルーを捨てる。
注：複数の線形化のミックスを準備している場合は、1つアミコン遠心フィルターユニットにすべてのソリューションを組み合わせる。 - アミコンフィルター上に溶液量が約100に減少するまで遠心分離〜150＆MU; L.上記から空のチューブに滅菌水のさらに1.5 mlを加え、アミコンチューブにソリューションを転送し、遠心分離のステップを繰り返します。滅菌水1.5mlで2回目を洗い、再びフロースルーを捨てる。 〜150μlに最終容量を減らす。洗浄ステップは、細胞をパルスする際にアーチ状のを防ぐためにバッファから残りの塩を取り除く。
注：我々は遠心分離のステップのためにスイングバケットローターを使用して、単に遠心分離中に所定の位置に保持するために50mLのファルコンチューブにキャップアミコン遠心フィルターユニットを配置。アミコンフィルター装置は、さらに長時間遠心分離した後、フィルター上に溶液50μlを保持する。 - DNA調製のさらなる濃度のために事前にすすぎマイクロコンYM - 30遠心フィルターユニットにアミコンフィルターデバイスから、残りのDNA溶液を転送し、すべてのDNAを回収するために滅菌水の追加の50μlをアミコンチューブをリンス。フィルタがまだわずかに液体で覆われるまで、10,000 xgで遠心のマイクロコン遠心フィルターユニットを遠心分離します。ほんの短い時間のために回転し、液体のわずかな量がフィルターに残っている場合、毎分をチェックしてください。あなたのDNA溶液を回収するために、3分間1000 × gでの第二の遠心分離工程における新しいマイクロ遠心チューブやスピンでフィルタ逆さまを下にして置かない。最終容量は合計で10〜15μlを超えてはならない、そうでなければ、あなたのDNAは、あまりに変換ステップのために希釈されることがあります。
注：長すぎるフィルタ装置を回転させ、それが潜在的なサンプルの損失を防ぐために、完全に乾燥させてはいけない。あなたのメンブレンが乾燥している場合、メンブレンに10〜15μlの滅菌水を追加し、30秒間静かに撹拌し、上記のようにDNAを回収。
パート3：P.への変革エレクトロポレーションにより、 ピキアパストリス
- インサートを含む線形化し、集中pPICZαAのDNAは、今のエレクトロP.への変換の準備ができていますパストリス細胞（ステップI、パート2を参照）。場所氷に0.2 cmのエレクトロポレーションキュベット; 1Mソルビトール1mLでマイクロ遠心チューブを記入し、氷の上に置きますラベル滅菌15mLのガラス管をし、滅菌している：変換前の約15分には、以下の試薬および機器を準備手でガラスパスツールピペット。
- 私、パート2.7は氷冷した0.2センチメートルのエレクトロポレーションキュベットにステップからの細胞の80μlを移す。エレクトロポレーションキュベットにサイドツーサイドからピペットの先端を動かすことによって、ステップI、パート3.6とミックスから濃縮された線形化pPICZαAのDNA溶液を加える。
注：DNAの追加は最初のピットストップにピペットをプッシュ。細胞とDNAを混合した後に目のストップにピペットを押すとゆっくりとキュベットから取り外します。 - 5分間氷上で細胞をキュベットをインキュベートする。
- 組織とキュベットの外側を拭き、として使用されている特定のエレクトロポレーションデバイスの製造元が推奨する酵母 （Saccharomyces cerevisiae）のパラメータにしたがって細胞をパルス。
注：我々は、以下の条件でBio - Rad社GenePulserを使用します。- 充電電圧（V）：1500;
- 静電容量（μF）：25;
- 抵抗（Ω）：200。
- すぐにキュベットにソルビトール氷冷した1 M 1 mLを加える。滅菌ガラスパスツールピペットを用いて滅菌、15 mLの試験管にキュベットの内容を転送します。
- 1.5時間振盪せずに30℃で真空管のインキュベートをしてみましょう。
- 100μg/ mlのゼオシンを含む4ラベル付けYPDSプレート5-7滅菌ガラスビーズを追加。各プレート上に15 mLのガラス管からのエレクトロミックス250μlを広げる。水平方向に均等に細胞を分散させるプレートを横に振る。プレートを15分間乾燥し、反転板で寒天からビーズを削除できます。
注：GS115 ピキア株を使用するときに我々は形質転換体を選択して100μg/ mlのゼオシンを使用する。別のピキア株を使用している場合は選択条件が異なる場合があります。 - コロニーの形になるまで30℃で2〜3日° Cのために逆さまにプレートをインキュベートする。光に敏感なゼオシンの劣化を防ぐために黒いプラスチックの板を巻きます。プレートの抗生物質の少ない量では偽陽性クローンになる可能性があります。
- コロニーが形成された後、12コロニーを選択し、ゼオシンの100μg/ mlのを含む新鮮なYPDSプレート上にクローンをストリーキングでそれらを精製する。
ステップII： ピキアパストリスにおけるタンパク質発現
このステップでは、手で次のメディア、プレートや試薬を持っている必要があります。
- BMGY培地
- グリセロール、滅菌
- BMMY媒体
- メタノール、滅菌
- EPICENTRE酵母のDNA精製キット
またまた以下フラスコを必要：
- オートクレーブした250mLフラスコ、
- 1 Lバッフルフラスコ、オートクレーブ
- オートクレーブを200mLビーカー、
パート1： ピキアパストリスにおけるタンパク質発現
次の手順のすべては、変換されたコントロールベクター（なしインサート付）に対して実行されます。
- 私、パート3.9は、ステップから精製されたピキアコロニーからシングルコロニーを採取し、滅菌した250mLのフラスコに25mLのBMGYに接種する。 30℃文化するまで振盪インキュベーター（250-300 RPM）におけるCはOD 600達する = 2-6（約16-18時間）。育つ
注：あなたが正確な結果を得るように分光光度計で測定する前にサンプルを希釈する。細胞は対数増殖期になります。 - 細胞はグリセロールストックを準備し、適切なOD 600に到達したときに。 2mLのコーニングcyrogenicバイアルに25mLの細胞培養の800μlのを移しと滅菌グリセロール200μlのを追加。 -80グリセロールストックおよびストアを凍結℃に
- 酵母のDNA精製のために、マイクロ遠心チューブに25 mlの細胞培養液1.5 mlを。室温で1分間1300 × gで遠心分離して細胞を収集する。これらの細胞は、目的の遺伝子は、 ピキアのゲノム（ステップII、その2を参照）に統合されている場合は、二重チェックするピキア integrantsを分析するために使用されています。 4時に細胞ペレットを保管° Cさらなる分析まで。
- 50mlのファルコンチューブに25 mlの培養液の残りを移し、室温で5分間3000 × gで遠心分離により細胞を収穫。デカントは上澄みといかなる残留メディアを除去する組織に逆さまチューブを置きます。ペレットは、BMGY培地からグリセロールとして、残りのBMGY培地を除去するために20mlのBMMYでそれを再懸濁し、細胞を洗浄するためには、後で発現を阻害することができます。室温で5分間3000 × gで再び遠心し上清をデカントする。
- BMMY培地に1.0のOD 600に再懸濁し、細胞ペレットの式（約100〜200 mL）を誘導し、1リットルバッフル付きフラスコでの培養を転送する。 200mLのビーカーにフラスコを覆い、30℃の成長を続けるためにインキュベーターに戻す℃に
注：それは温度が30超過しないよう重要℃であるあなたのインキュベーターの変動の温度は、28で温度を設定すると℃に十分な通気が（発現を誘導する際、培養液量を超えることはない>の合計フラスコの容積の10〜30％）をメタノール誘導時にも効率的な発現のための重要なパラメータです。彼らは培地でより多くの酸素を導入すると我々は非常に、バッフルフラスコを使用することをお勧めします。 - 誘導を維持するために24時間ごとに0.5％メタノールの終濃度に滅菌純メタノールを追加。
- 1.5 mlのマイクロ遠心チューブへの文化の表現の転送を1 mLの開始後の一定の時点で。室温で2.5分間1300 × gで遠心する。別の1.5 mLのマイクロ遠心チューブに上清を移す。さらに、分析まで-80℃で上清と細胞ペレット℃で保管してください。異なる時点からのサンプルは、誘導後のタンパク質発現に最適な期間を確立するために分析されます。
注：我々はサンプルを取るための時間のポイントとして6H、12H、24時間、36Hと48時間を選択します。最大4日数までさらなる成長は可能です。最適なタイムポイントは、異なる発現タンパク質によって異なります。 - クマシー染色SDS - PAGEとウェスタンブロット（このプロトコルで説明せず）によってタンパク質発現用上清と細胞ペレットを分析。
パート2：酵母DNA精製とピキア一味のPCR分析
BMGYのピキア文化の酵母のDNA精製工程に必要なすべての試薬 はEPICENTREからMasterPure酵母のDNA精製キットに含まれています。
注：この分析は、追加で、目的の遺伝子は、 ピキアのゲノムに組み込まれているかどうかを判断するために行われる。 BMGYの文化（ステップII、一部1.3を参照）から採取した1.5 mLのサンプルからの細胞ペレットが使用されます。
EPICENTRE MasterPure酵母DNA精製マニュアルの指示に従って、インサート用特異的プライマー付き酵母DNA持つPCRを実行。 1μLエチジウムブロマイドを含むアガロースゲル上PCR製品3μlのを分析。あなたのインサートの大きさを解釈し、ゲルドキュメンテーションステーションを使用してDNAを可視化するだけでなくつで1 KB +サイズマーカーが含まれています。
組換えタンパク質を、ウェスタンブロット分析によって分析することができます。タンパク質の精製は、金属に帯電した樹脂（このプロトコールに記載されていない）にHisタグ精製によって行うことができます。
付録、レシピのリスト
ステップI：
- YPD培地 ：
600mLのを準備するにはYPD培地（酵母エキスペプトンデキストロース培地）5gの酵母エキスと水540 mLに12gのペプトンを溶かす。液体サイクルで20分間オートクレーブ。
その間に20％ブドウ糖70 mlを調製し、使用前にフィルター滅菌する。
〜60 ° Cとろ過滅菌した20％ブドウ糖60mLの追加にクールなオートクレーブソリューションをしましょう。 - YPDS（+ゼオシン）プレート ：
YPDSの500mLの+ゼオシンの寒天（ソルビトールと酵母エキスペプトンデキストロース培地）を調製するためには、5gの酵母エキス、水450mlに91.1グラムソルビトールおよび10gのペプトンを溶かす。液体サイクルで20分間寒天とマグネチックスターラーバーとオートクレーブの10グラムを追加。
その間に20％ブドウ糖60 mlを調製し、使用前にフィルター滅菌する。
〜60〜オートクレーブソリューションは冷ます° C、フィルター滅菌した20％ブドウ糖50mLを加える。
ゼオシンなしYPDSプレートの抗生物質を追加する前にいくつかのプレートを注ぐ。その後、寒天で100μg/ mlのゼオシンの最終濃度を得るためには100 mg / mlのストック溶液から500μlのゼオシンを追加。抗生物質を追加するときに磁気プレートにかき混ぜると均等に混合するために追加の2分間程度攪拌させてみましょう。
ペトリ皿に培地を注ぎ、黒のプラスチックでカバー。プレートは一晩ベンチに乾燥させます。 4でゼオシンを含む店舗YPDプレート℃に貯蔵寿命は1〜2週間です。
注：ゼオシンは光に敏感であるため、プラスチックとの報道が必要です。
ステップII：
- BMGY（グリセロール複合体培地バッファ）とBMMY（メタノール-複雑なミディアムバッファ）：
酵母エキスと560 mLの水で16 gのペプトンの各媒体8 gに溶解する。液体サイクルで20分間オートクレーブ。
その間、以下のソリューションを準備してください。- 1 Mリン酸カリウム緩衝液、pH6.0：
- 10X YNB（アミノ酸を含まない硫酸アンモニウム13.4％酵母窒素塩基）：
- 500X B（0.02％ビオチン）：
- 10X M（5％メタノール）：
- 10X GY（10％グリセロール）：
室温まで冷却オートクレーブソリューションは、次を加え、よく混ぜるみましょう。- 80mLの1 Mリン酸カリウム緩衝液、pH 6.0;
- 80mLの10倍YNB
- 0.16 mLの500X B
- 80mLの10倍GY
4℃ストアメディア℃のこのソリューションの貯蔵寿命は約2ヶ月です。
代表的な結果
図1。このウェスタンブロットの画像は、式の24時間後、4つの発現タンパク質を（1605、0537、1228、および1682と表記）を示しています。イムノブロットに用いる抗体は、c - MYC - HRP抗体いました。第二車線は（N標識）、ネガティブコントロールであると彼らは親（プレーン）ベクターで形質転換されたため、組換えタンパク質を発現しない細胞からの上清がロードされました。
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Discussion
ホストシステムとしてメチロトローフ酵母Pichia pastorisにを使用してタンパク質発現は、このプロトコルで説明されています。タンパク質は、使用されるクローニングベクターに応じて、培地中に分泌することができます。組換えタンパク質の分泌は、その後の精製が容易になります。しかし、示した条件が増加し、タンパク質レベルで生じることが条件と発現時間の異なる蛋白質と変化の発現に最適化する必要があります。このプロトコルで使用されているベクトルは 、c - mycのエピトープの機能を持っており、このエピトープに対する抗体を購入することができます。これは、抗体がまだ利用がないとなるタンパク質の分析を行うことができます。親ベクターのHisタグ機能は、金属キレート樹脂にタンパク質の精製を容易にし、利用可能なベクトルのHisタグ部に対する抗体もあります。
このプロトコールに記載されているように、 ピキアパストリスにおけるタンパク質発現は、よく計画し、準備する必要がマルチステッププロセスです。 2〜3週間の時間がすべての手順を実行する必要が目的の遺伝子を持つコンストラクトのクローニング除外される。 P.に成功した変換のための基礎ピキアパストリスは、高い変換効率のコンピテント酵母細胞および酵母ゲノムに統合できる線形化された構造です。ウェスタンブロット分析およびHis -タグの精製は、組換えタンパク質の発現レベルを決定するためのアプリケーションであり、このプロトコルの後に実行するために次のステップです。
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Acknowledgments
我々はこの作業を支援するためのイノベーション、ブリティッシュコロンビア州の知識開発基金、及び保健研究（CIHR）のカナダの協会のためのカナダの財団に感謝の意を表します。 MTは、微生物の多様性と進化（CMDE）用トゥーラ基礎資金センターからのフェローシップでサポートされていました。
References
- Cereghino, G. P., Cregg, J. M. Applications of yeast in biotechnology: protein production and genetic analysis. Curr Opin Biotechnol. 10, 422-427 (1999).
- Cregg, J. M., Barringer, K. J., Hessler, A. Y. Pichia pastoris as a Host System for Transformations. Mol. Cell. Biol. 5, 3376-3385 (1985).
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