Summary
Protokollet beskriver protein uttryck med methylotrophic jäst
Abstract
Protein uttryck i den mikrobiella eukaryota värd Pichia pastoris ger möjlighet att generera höga halter av rekombinant protein i ett snabbt och enkelt att använda uttryck system.
Som en encelliga mikroorganismer s. pastoris är lätt att manipulera och växer snabbt på billiga medier vid höga cell tätheter. Att vara en eukaryota, s. pastoris kan utföra många av post-translationella modifieringar som utförs av högre eukaryota celler och de erhållna rekombinanta proteiner genomgår proteinveckning, proteolytiska bearbetning, disulfid band bildas och glykosylering [1].
Som en methylotrophic jäst P. pastoris kan metaboliserande metanol som enda kolkälla. Den starka promotor för alkohol oxidas, AOX1, är hårt reglerad och induceras av metanol och det används för uttrycket av genen av intresse. Följaktligen kan uttrycket av den främmande protein sättas igång genom att lägga till metanol till odlingsmedium [2, 3].
En annan viktig fördel är utsöndring av rekombinant protein i odlingsmedium, med hjälp av en signal sekvens för att rikta främmande protein till Utsöndringsvägarna av P. pastoris. Med endast låga nivåer av endogent protein som utsöndras till media av jästen själv och utan tillsats av proteiner till media, bygger en heterologa proteiner majoriteten av det totala proteininnehållet på medellång och underlättar följande steg proteinrening [3, 4].
Den vektor som används här (pPICZαA) innehåller AOX1 promotor för hårt reglerad, metanol-inducerad uttryck av genen av intresse, det α-faktorn sekretion signal för sekretion av rekombinant protein, en Zeocin motstånd genen för val i både E. coli och Pichia och en C-terminal peptid som innehåller c-Myc epitopen och en polyhistidine (6xHis) tag för att upptäcka och rening av ett rekombinant protein. Vi visar även Western Blot analys av rekombinanta proteiner med hjälp av specifika anti-Myc-HRP antikropp erkänna c-Myc epitopen på den överordnade vektor.
Protocol
Expression av rekombinanta proteiner i methylotrophic jäst Pichia pastoris
Innan du börjar detta protokoll bör du ha din genen av intresse klonas i ram i en P. vektor pastoris förälder och ha det sekvenserade att kontrollera om rätt att genen av intresse i Vector.
Steg I: Generera electrocompetent jästceller, linjärisering av konstruktionen och omvandling till P. pastoris
För detta steg behöver du ha följande media och tallrikar till hands:
- YPDS plattor
- 600 ml YPD medelstora
- iskallt sterilt vatten
- 1 M sorbitol
- Amicon Ultra-4 Centrifugal filterapparat
- Microcon YM-30 Centrifugal filter
- 0,2 cm elektroporation kyvett
- 15 ml sterilt glasrör
- sterila glas pasteurpipett
- YPDS plattor innehåller Zeocin
Del 1: Förberedelser för electrocompetent jästceller
- Fyra dagar innan den planerade omvandlingen strimma ut s. pastoris celler på ett YPDS tallrik utan Zeocin och låta dem växa ett 30 ° C i 1-2 dagar eller tills enstaka kolonier form.
- Två dagar innan avsedd omvandling växa 5 ml dina P. pastoris stam i YPD medium i en 50 ml Falcon rör vid 30 ° C över natten. Placera Falcon röret i en kolv för att fixa det i shakern.
- Dagen före omvandlingen inokulera 500 ml rent YPD medium i en 2 liters flaska med 0,25 ml av natten kulturen och låta växa över natten igen i en shaker vid 30 ° C till en OD 600 = 1,3 till 1,5.
OBS: Späd ditt prov före mätning på spektrofotometern så att du får ett korrekt resultat. - Dagen för omvandling har iskalla sterilt vatten och 1 M sorbitol till hands. Centrifugera cellerna vid 1500 xgi 5 minuter vid 4 ° C. Suspendera pelleten med 500 ml iskallt, sterilt vatten.
- Centrifugera cellerna igen som steg 4. Suspendera pelleten med 250 ml iskallt, sterilt vatten.
- Centrifugera cellerna igen som i steg 4. Återsuspendera pelleten i 20 ml iskall 1 M sorbitol.
- Centrifugera cellerna igen som i steg 4. Återsuspendera pelleten i 1 ml iskall 1 M sorbitol till en slutlig volym på ~ 1,5 ml. Förvara cellerna på is eller vid 4 ° C fram till användning.
Obs: vi förbereder fler electrocompetent celler än vad som behövs och lagra dem i portioner av 80 l i mikrocentrifugrör vid -80 ° C. Vi använder den lagrade celler inte längre än en månad.
Del 2: linjärisering och koncentration av pPICZαA konstruera
För omvandling linjärisera vektorn innehåller din gen av intresse genom begränsningar smälta. Vi använder enzym PmeI. Andra begränsningar platser är möjliga. Du måste se till att ditt sätt inte innehåller begränsningar webbplats du vill använda för att linjärisera din vektor. För omvandling till s. pastoris du behöver 5-20 mikrogram linjäriserade DNA i 5-10 l sterilt vatten.
Även linjärisera, koncentrera och överföra slätten vektorn (ingen insats) till P. pastoris. Föräldern vektorn utan insatsen är en kontroll för bakgrunden intracellulära uttryck och gör att du kan tolka ditt uttryck resultat.
- Tina alla reagenser på is, kombinera följande reagenser och kort centrifugera röret för att få all vätska till botten, tryck på tuben och snurra igen:
- x l sterilt vatten
- 5,0 l 10X NEBuffer 4
- 0,5 l 100X BSA
- upp till 2 mikrogram vektor-DNA (~ 100 ng / l)
- 2,0 l PME Jag enzym blandning
Observera: att erhålla tillräckligt linjäriserade vektor DNA förbereda ovanstående mix 3 eller 4 gånger i separata rör och kombinera lösningar när koncentrera rötas DNA via Amicon Ultra Centrifugal enhet. - Inkubera vid 37 ° C i 3 timmar och värme inaktivera enzymet blandningen vid 65 ° C i 20 minuter.
- Under tiden före skölja en Amicon Ultra-4 centrifugaltyp filterapparat med 1 ml Milli-Q vatten, snurra röret vid 4000 xg i 6-8 minuter och kasta passera.
Obs: Låt inte membranet torka ut gång våt. Om du inte använder enheten efter före sköljning, lämnar vatten på membranet tills enheten används. - Överför värmeinaktiveras lösning från steg 2 till pre-sköljda Amicon Radialfläkt filterenhet, snurra röret vid 4000 xg i 6-8 minuter och kasta passera.
Obs: om du har förberett mer än en linjärisering mix, kombinera alla lösningar i en Amicon Radialfläkt filter. - Centrifugera tills mängd lösning på Amicon filtret är reducerad till cirka 100 ~ 150 & mu; l. Lägg till ytterligare 1,5 ml sterilt vatten för att den tomma tuben från ovan och överför lösningen till Amicon röret och upprepa centrifugering steget. Tvätta en gång med 1,5 ml sterilt vatten och släng flödet genom igen. Minska den slutliga volymen till ~ 150 l. Tvätten steg bort kvarvarande saltet från bufferten för att förhindra övergripande när pulserande cellerna.
Observera: Vi använder en svängig hink rotor för centrifugeringssteget, helt enkelt placera utjämnade Amicon centrifugala filterenhet i en 50 ml Falcon rör för att hålla den på plats under centrifugering. Amicon filter enheter behåller 50 ìl av lösningen på filtret även efter förlängd centrifugering. - För ytterligare koncentration av DNA-preparation överföra den återstående DNA-lösning från Amicon filtret enheten till en pre-sköljs Microcon YM-30 Centrifugal filterenhet och skölj Amicon röret med ytterligare 50 ìl av sterilt vatten för att återställa alla DNA. Centrifugera Microcon Radialfläkt filterenheten i mikrocentrifug vid 10000 xg tills filtret är fortfarande lite täckt av vätska. Bara snurra för en kort tid och kontrollera varje minut om endast en liten mängd vätska kvar på filtret. För att få tillbaka ditt DNA-lösning, placera filtret upp och ned i en ny mikrocentrifugrör och snurra i en andra centrifugering steg vid 1000 xgi 3 minuter. Den slutliga volymen bör inte överstiga 10-15 l totalt, annars ditt DNA kan vara för utspädd för omvandlingen steg.
Obs! Snurra inte filtret enheten för länge och låt den inte torka helt för att förhindra potentiella prov förlust. Om din membranet är torr, tillsätt 10-15 l sterilt vatten på membranet, agitera försiktigt i 30 sekunder och återställa ditt DNA som beskrivits ovan.
Del 3: Omvandling till P. pastoris av elektroporation
- Den temperaturlinjär och koncentrerade pPICZαA DNA innehåller din Insatsen är nu redo för omvandling till electrocompetent P. pastoris celler (se steg I, del 2). Ungefär 15 minuter innan omvandlingen förbereda följande reagenser och enheter: Fyll en mikrocentrifugrör med 1 ml 1 M sorbitol och placera den på is, placera en 0,2 kyvett cm elektroporation på is, etikett en steril 15 ml provrör och ha en steril glas pasteurpipett till hands.
- Överför 80 ìl av celler från steg I, del 2,7 till en iskall 0,2 cm elektroporation kyvett. Tillsätt den koncentrerade linjäriserade pPICZαA DNA-lösning från steg I, del 3,6 och blanda genom att flytta pipettspetsen från sida till sida i elektroporering kyvetten.
Observera: när du lägger DNA bara skjuta pipett till första stoppet. Efter blandning DNA med cellerna tryck pipetten till det andra stoppet och långsamt bort från kyvetten. - Inkubera kyvetten med cellerna på is i 5 minuter.
- Torka utsidan av kyvetten med en vävnad och puls cellerna enligt parametrarna för jäst (Saccharomyces cerevisiae) som föreslagits av tillverkaren av den specifika elektroporation enhet som används.
Observera: Vi använder en Bio-Rad GenePulser med följande villkor:- Laddningsspänning (V): 1500;
- Kapacitans (uF): 25;
- Resistans (Ω): 200.
- Omedelbart Tillsätt 1 ml iskall 1 M sorbitol till kyvetten. Överför kyvetten innehållet till ett sterilt 15 ml rör med steril glaset pasteurpipett.
- Låt röret inkubera vid 30 ° C utan att skaka i 1,5 timmar.
- Lägg 5-7 steriliserade glaspärlor på fyra märkt YPDS plattor som innehåller 100 mikrogram / ml Zeocin. Sprid 250 ìl av elektroporation mix från 15 ml provrör på varje tallrik. Skaka plattan horisontellt för att jämnt sprida ut cellerna. Låt plattan torka i 15 minuter och ta sedan bort pärlorna från agar genom att vända plattan.
Observera: Vi använder 100 mikrogram / ml Zeocin välja för transformants när du använder GS115 Pichia stammen. Urvalet villkoren kan variera om du använder en annan Pichia stam. - Inkubera plattorna upp och ned i 2 till 3 dagar vid 30 ° C tills kolonier form. Linda plattorna i en svart plast för att förhindra nedbrytning av ljuskänsliga Zeocin. Mindre mängd antibiotika i plattorna kan leda till felaktiga positiva kloner.
- Efter att kolonierna har bildat, plocka 12 kolonier och rena dem med strimmor klonerna på färska YPDS plattor som innehåller 100 mikrogram / ml Zeocin.
Steg II: Protein uttryck i Pichia pastoris
För detta steg måste du ha följande media, tallrikar och reagens till hands:
- BMGY medelstora
- glycerol, steriliserade
- BMMY medelstora
- metanol, steriliserade
- EPICENTRUM Jäst DNA-rening kit
Dubehöver också följande flaskor:
- 250 ml kolv, autoklaveras
- 1 L förbryllad kolv, autoklaveras
- 200 ml bägare, autoklaveras
Del 1: Protein uttryck i Pichia pastoris
Alla följande steg utförs även för förvandlas kontroll vektor (utan insats).
- Välj en koloni från det renade Pichia kolonierna från steg I, del 3,9 och inokulera i 25 ml BMGY i en steril 250 ml kolv. Växer vid 30 ° C i en skakande inkubator (250-300 rpm) tills kulturen når en OD 600 = 2-6 (ca 16-18 timmar).
OBS: Späd ditt prov före mätning på spektrofotometern så att du får ett korrekt resultat. Cellerna kommer att vara i log-fas tillväxt. - När cellerna har nått lämplig OD 600 förbereda en glycerol lager. Överför 800 ìl av 25 ml cellodling till en 2 ml Corning cyrogenic flaskan och tillsätt 200 l av steriliserad glycerol. Frys glycerol lager och förvara vid -80 ° C.
- För jäst DNA-rening, överlåtelse 1,5 mL av 25 ml cellodling till ett mikrocentrifugrör. Harvest cellerna genom centrifugering vid 1300 xg i 1 minut vid rumstemperatur. Dessa celler används för att analysera Pichia integrants att dubbelkolla om genen av intresse har integrerats i Pichia genomet (se steg II, part2). Förvara cellpelleten vid 4 ° C tills vidare analys.
- Överföring resten av 25 ml kultur till en 50 ml Falcon rör och skörda cellerna genom centrifugering vid 3000 xgi 5 minuter vid rumstemperatur. Dekantera supernatanten och placera rören upp och ner på en servett för att undanröja eventuella återstående media. Att tvätta cellpelleten återsuspendera det i 20 ml BMMY att undanröja eventuella återstående BMGY medium, som glycerol från BMGY mediet kan hämma senare uttrycket. Centrifugera igen vid 3000 xgi 5 minuter vid rumstemperatur och dekantera supernatanten.
- Resuspendera cellpelleten till en OD 600 på 1,0 i BMMY medel att förmå uttryck (ca 100-200 ml) och överför kulturen i ett förvånat 1 liters mätkolv. Täck kolven med en 200 ml bägare och återgå till inkubatorn för att fortsätta tillväxten vid 30 ° C.
OBS: Det är viktigt att temperaturen inte överstiger 30 ° C. Om temperaturen i ditt inkubator varierar, ställ in temperaturen på 28 ° C. Adekvat luftning är också en viktig parameter för effektiv uttryck under metanol induktion (när inducerande uttryck, aldrig överstiga en kultur volym> 10-30% av din totala kolvens volym). Vi rekommenderar användning av förbryllade kolvar, eftersom de införa mer syre i kulturen media. - Lägg till steriliserade ren metanol till en slutlig koncentration av 0,5% metanol var 24 timmar för att upprätthålla induktion.
- Vid vissa tidpunkter efter starten av uttrycket över 1 ml av kulturen till ett 1,5 ml mikrocentrifugrör. Centrifugera vid 1300 xgi 2,5 minuter vid rumstemperatur. Överför supernatanten till en separat 1,5 ml mikrocentrifugrör. Förvara supernatanten och cell pellets vid -80 ° C tills vidare analys. Proverna från olika tidpunkter kommer att analyseras för att fastställa den optimala tidsperioden för proteinuttryck efter induktion.
Obs: vi väljer 6h, 12h, 24h, 36h och 48h som tidpunkter för provtagning. Ytterligare tillväxt upp till 4 dagar är möjlig. Den optimala tidpunkter varierar mellan olika uttrycks proteiner. - Analysera supernatanterna och pellets cellen för protein uttryck genom Coomassie färgade SDS-PAGE och Western Blot (som inte beskrivs i detta protokoll).
Del 2: Jäst DNA-rening och PCR-analys av Pichia integrant
Alla reagenser som behövs för att jästen DNA-rening steg i Pichia kultur i BMGY ingår i MasterPure Jäst DNA Purification Kit från EPICENTRUM.
Observera: denna analys är ytterligare och utförs för att avgöra om genen av intresse har integrerats i Pichia genomet. Cellpelleten från en 1,5 mL prov från kulturen i BMGY (se steg II, del 1.3) används.
Följ instruktionerna för Epicentrum MasterPure Jäst DNA Rening manual och köra en PCR med jästen DNA med specifika primers för insatsen. Analysera 3 l av din PCR-produkt på en agarosgel innehållande 1 l ethidiumbromid. Inkludera en 1 Kb +-storlek markör i en väl tolka storleken på ditt sätt och visualisera DNA med en gel dokumentation station.
Den rekombinant protein kan analyseras med Western blot-analys. Protein rening kan utföras av Hans-tagg rening på metall laddade-harts (som inte beskrivs i detta protokoll).
Bilaga, förteckning över recept
Steg I:
- YPD medium:
För att förbereda 600 mlav YPD medium (Jästextrakt Peptone Dextros Medium) Lös 5 g jästextrakt och 12 g pepton i 540 ml vatten. Autoklav i 20 minuter på flytande cykel.
Under tiden förbereder 70 ml 20% glukos och filter-sterilisera före användning.
Låt autoklaveras lösningen svalna till ~ 60 ° C och tillsätt 60 ml av filter-steriliserade 20% dextros. - YPDS (+ Zeocin) plattor:
För att förbereda 500 ml YPDS + Zeocin agar (Jästextrakt Peptone Dextros Medium med sorbitol) Lös upp 5 extrakt g jäst, 91,1 g sorbitol och 10 g pepton i 450 ml vatten. Tillsätt 10 g agar och en magnetisk omrörare och autoklav i 20 minuter på flytande cykel.
Under tiden förbereder 60 ml 20% glukos och filter-sterilisera före användning.
Låt autoklaveras lösningen svalna till ~ 60 ° C, tillsätt 50 ml av filter-steriliserade 20% dextros.
Häll några plattor innan du lägger till antibiotika för YPDS plattor utan Zeocin. Tillsätt sedan 500 l Zeocin från en 100 mg / ml stamlösning för att erhålla en slutlig koncentration av 100 mikrogram / ml Zeocin i agar. Låt röra om på ett magnetiskt tallrik när du lägger till antibiotika och låt rör om ca ytterligare 2 minuter för att lika mix.
Häll media i petriskålar och täck med svart plast. Låt plattorna torka på bänken över natten. Förvara YPD plattorna innehåller Zeocin vid 4 ° C. Hållbarhetstiden är en till två veckor.
OBS: täckning med plast är nödvändigt eftersom Zeocin är ljuskänsligt.
Steg II:
- BMGY (buffrat Glycerol-komplex Medium) och BMMY (buffrat Metanol-komplex Medium):
Lös för varje medium 8 g jäst extrakt och 16 g pepton i 560 ml vatten. Autoklav i 20 minuter på flytande cykel.
Under tiden förbereder följande lösningar:- 1 M kaliumfosfat buffert, pH 6,0:
- 10X YNB (13,4% Jäst Nitrogen Base med ammoniumsulfat utan aminosyror):
- 500X B (0,02% Biotin):
- 10X M (5% metanol):
- 10X GY (10% glycerol):
Låt autoklaveras lösningen svalna till rumstemperatur, tillsätt sedan följande och blanda väl:- 80 ml 1 M kaliumfosfat buffert, pH 6,0;
- 80 ml 10X YNB
- 0,16 ml 500X B
- 80 ml 10X GY
Förvara medier vid 4 ° C. Hållbarheten för denna lösning är cirka två månader.
Representativa resultat
Figur 1. Detta Western Blot Bilden visar fyra uttryckta proteinerna (märkt 1605, 0537, 1228 och 1682) efter 24 timmars uttryck. Antikroppen som används för immunoblotting var en c-Myc-HRP antikropp. Det andra körfältet (märkta N) är en negativ kontroll och var lastad med supernatanten från celler som inte uttrycker ett rekombinant protein eftersom de var förvandlade med moderbolaget (vanligt) vektor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protein uttryck med methylotrophic pastoris jästen Pichia som ett värdsystem beskrivs i detta protokoll. Proteinet kan utsöndras i mediet beroende på vilken kloningsvektor. Utsöndring från rekombinant protein gör den efterföljande rening lättare. Kan dock visat villkor måste vara optimerade för uttryck av olika proteiner och förändringar i de villkor och tider uttryck kan resultera i ökad protein nivåer. Den vektor som används i detta protokoll har funktionen av en c-Myc epitopen och en antikropp för epitop kan köpas. Detta gör att analys av proteiner för vilka det finns inga antikroppar ännu inte tillgängliga. Den Hans-taggen inslag i den överordnade vektor underlättar proteinrening på metall-komplexbildare harts och det finns också en antikropp för Hans-taggen delen av vektor finns.
Som beskrivs i detta protokoll är protein uttryck i Pichia pastoris en flerstegsprocess-process som måste vara väl planerad och förberedd. En tid av två till tre veckor är skyldig att utföra alla steg men exklusive kloning av konstruktionen med genen av intresse. Grunden för en lyckad omvandling till s. pastoris är höga omvandling effektiva behöriga jästceller och en linjär konstruktion som kan integreras i jästgenomet. Western blot analys och Hans-taggen rening är program för att bestämma nivån av rekombinant protein uttryck och är nästa steg att utföra när detta protokoll.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi vill tacka det kanadensiska institutet för innovation, British Columbia Kunskap utvecklingsfonden, och den kanadensiska Institutes of Health Research (CIHR) för att stödja detta arbete. MT fick stöd av ett stipendium från Tula stiftelsen finansierade Centrum för Mikrobiell diversitet och evolution (CMDE).
References
- Cereghino, G. P., Cregg, J. M. Applications of yeast in biotechnology: protein production and genetic analysis. Curr Opin Biotechnol. 10, 422-427 (1999).
- Cregg, J. M., Barringer, K. J., Hessler, A. Y. Pichia pastoris as a Host System for Transformations. Mol. Cell. Biol. 5, 3376-3385 (1985).
- Cregg, J. M., Cereghino, J. L., Shi, J., Higgins, D. R.
- Cereghino, G. P., Cereghino, J. L., Ilgen, C., Cregg, J. M. Production of recombinant proteins in fermenter cultures of the yeast Pichia pastoris. Curr Opin Biotechnol. 4, 329-332 (2002).
