Summary
Il protocollo descrive l'espressione della proteina usando il lievito methylotrophic
Abstract
Espressione della proteina in Pichia pastoris microbica eucariotica ospitante offre la possibilità di generare elevate quantità di proteina ricombinante in un sistema di espressione veloce e facile da usare.
Come un microrganismo unicellulare P. pastoris è facile da manipolare e cresce rapidamente su un supporto economico a densità elevata delle cellule. Essendo un eucariote, P. pastoris è in grado di eseguire molte delle modificazioni post-traduzionali eseguiti dai maggiori cellule eucariotiche e le proteine ricombinanti ottenuti subiscono ripiegamento delle proteine, maturazione proteolitica, la formazione di legame disolfuro e glicosilazione [1].
Come un lievito P. methylotrophic pastoris è in grado di metabolizzare metanolo come unica fonte di carbonio. Il promotore forte per l'alcol ossidasi, AOX1, è strettamente regolato e indotta da metanolo ed è utilizzato per l'espressione del gene di interesse. Di conseguenza, l'espressione della proteina estranea può essere indotta con l'aggiunta di metanolo al mezzo di crescita [2, 3].
Un altro vantaggio importante è la secrezione della proteina ricombinante nel mezzo di crescita, utilizzando una sequenza segnale per indirizzare la proteina estranea al via secretoria di P. pastoris. Con solo i bassi livelli di proteina endogena secreta alla stampa dallo stesso lievito e senza proteine aggiunti ai media, una proteina eterologa costruisce la maggior parte delle proteine totali nel medio e facilita le seguenti fasi di purificazione proteica [3, 4].
Il vettore usato qui (pPICZαA) contiene il promotore per AOX1 strettamente regolamentati, metanolo-indotta espressione del gene di interesse, il fattore-α segnale di secrezione per la secrezione della proteina ricombinante, un gene di resistenza Zeocin per la selezione sia in E. coli e Pichia e un C-terminale del peptide contenente il c-myc e un epitopo (6xHis) tag polyhistidine per il rilevamento e la purificazione di una proteina ricombinante. Mostriamo anche l'analisi western blot della proteina ricombinante utilizzando lo specifico anti-myc HRP-anticorpo che riconosce il c-myc epitopo sul vettore genitore.
Protocol
Espressione di proteine ricombinanti nel lievito Pichia pastoris methylotrophic
Prima di iniziare questo protocollo si dovrebbe avere il tuo gene di interesse clonato in frame in una P. genitore vettore pastoris e lo hanno sequenziato per verificare il corretto inserimento del gene di interesse nel vettore.
Fase I: Generare cellule di lievito electrocompetent, linearizzazione del costrutto e la trasformazione in P. pastoris
Per questa fase è necessario avere i seguenti supporti e le piastre a portata di mano:
- YPDS piastre
- 600 ml YPD media
- acqua ghiacciata sterile
- 1 sorbitolo M
- Amicon Ultra-4 dispositivi centrifuga Filtro
- Microcontrollore YM-30 Unità di centrifuga Filtro
- 0,2 centimetri elettroporazione cuvetta
- 15 ml tubo di vetro sterili
- pipetta Pasteur sterile di vetro
- Piastre YPDS contenente Zeocin
Parte 1: Preparazione di cellule di lievito electrocompetent
- Quattro giorni prima della striscia trasformazione destinati fuori P. cellule pastoris su un piatto YPDS senza Zeocin e farli crescere a 30 ° C per 1-2 giorni o fino alla singola forma colonie.
- Due giorni prima trasformazione destinati crescere 5 ml di tuo P. ceppo pastoris in media YPD in un tubo Falcon da 50 ml a 30 ° C durante la notte. Posizionare il tubo Falcon in un pallone di risolvere il problema nello shaker.
- Il giorno prima della trasformazione inoculare 500 ml di fresca medio YPD in un pallone 2 litro con 0,25 mL della coltura durante la notte e far crescere di nuovo durante la notte in uno shaker a 30 ° C ad un OD 600 = 1,3-1,5.
Nota: diluire il campione prima di misurare il spettrofotometro in modo da ottenere un risultato preciso. - Il giorno della trasformazione hanno gelida acqua sterile e 1 M sorbitolo a portata di mano. Centrifugare le cellule a 1500 xg per 5 minuti a 4 ° C. Risospendere il pellet con 500 ml di ghiaccio freddo, acqua sterile.
- Centrifugare le cellule di nuovo come al punto 4. Risospendere il pellet con 250 ml di ghiaccio freddo, acqua sterile.
- Centrifugare le cellule di nuovo come al punto 4. Risospendere il pellet in 20 ml di ghiacciata 1 M sorbitolo.
- Centrifugare le cellule di nuovo come al punto 4. Risospendere il pellet in 1 ml di ghiacciata 1 M sorbitolo ad un volume finale di circa 1,5 ml. Conservare le cellule in ghiaccio o a 4 ° C fino a quando un ulteriore uso.
Nota: ci prepariamo electrocompetent cellule più del necessario e memorizzarli in aliquote da 80 microlitri in tubi microcentrifuga a -80 ° C. Utilizziamo le cellule conservati per non più di un mese.
Parte 2: linearizzazione e la concentrazione del costrutto pPICZαA
Per la trasformazione linearizzare il vettore contenente il gene di interesse per restrizione digerire. Usiamo il PmeI enzima. Siti di restrizione sono possibili altre. Devi fare in modo che il tuo inserimento non contiene il sito di restrizione che si desidera utilizzare per linearizzare il vettore. Per la trasformazione in P. pastoris avrete bisogno di 5-20 mg di DNA linearizzato in 5-10 microlitri di acqua sterile.
Inoltre linearizzare, concentrato e trasferire il vettore normale (non inserire) in P. pastoris. Il vettore genitore senza l'inserto è un controllo per l'espressione intracellulare di fondo e ti permette di interpretare i risultati delle espressioni.
- Scongelare tutti i reagenti sul ghiaccio, unire i seguenti reagenti e brevemente centrifugare la provetta per ottenere tutto il liquido sul fondo, toccare il tubo e far girare di nuovo:
- x microlitri di acqua sterile
- 5,0 4 microlitri NEBuffer 10X
- 0,5 microlitri 100X BSA
- fino a 2 mg di DNA vettore (~ 100 ng / mL)
- 2,0 microlitri enzima Pme impasto
Nota: per ottenere sufficienti di DNA linearizzato vettore preparare l'impasto sopra 3 o 4 volte in tubi separati e combinare le soluzioni quando concentrando il DNA digerito tramite dispositivi Ultra Amicon centrifuga. - Incubare a 37 ° C per 3 ore e calore inattivare il mix enzima a 65 ° C per 20 minuti.
- Nel frattempo prelavaggio un Ultra-4 Amicon dispositivo centrifugo di filtraggio con 1 ml di acqua Milli-Q, ruotare il tubo a 4000 xg per 6-8 minuti ed eliminare il flusso attraverso.
Nota: non permettere la membrana di asciugarsi una volta bagnato. Se non si utilizza il dispositivo dopo il pre-lavaggio, lasciare acqua sulla membrana fino a quando il dispositivo viene utilizzato. - Trasferire il calore inattivato soluzione dal punto 2 al pre-sciacquato Unità Filtro Amicon centrifuga, ruotare il tubo a 4000 xg per 6-8 minuti ed eliminare il flusso attraverso.
Nota: se avete preparato più di un mix di linearizzazione, unire tutte le soluzioni in una sola unità filtro Amicon centrifuga. - Centrifuga fino a quando la quantità di soluzione sul filtro Amicon è ridotta a circa 100 ~ 150 & mu; l. Aggiungere altri 1,5 ml di acqua sterile per il tubo vuoto dall'alto e trasferire la soluzione al tubo Amicon e ripetere la fase di centrifugazione. Lavare una seconda volta con 1,5 ml di acqua sterile ed eliminare il flusso attraverso di nuovo. Ridurre il volume finale a ~ 150 microlitri. Le fasi di lavaggio rimuovere il sale rimanente dal buffer per evitare inarcamento pulsare quando le cellule.
Nota: si usa un rotore oscillante per la fase di centrifugazione, è sufficiente posizionare il tappo unità centrifuga Amicon filtro in una provetta da 50 ml Falcon per tenerlo in posizione durante la centrifugazione. Amicon dispositivi filtro conservare 50 ml di soluzione sul filtro anche dopo centrifugazione estesa. - Per un'ulteriore concentrazione della preparazione del DNA si trasferisce la soluzione residua del DNA dal dispositivo Amicon filtro a un pre-sciacquato microcontrollore YM-30 Unità di centrifuga Filtro e risciacquare il tubo Amicon con altri 50 ml di acqua sterile per recuperare tutto il DNA. Centrifugare la centrifuga Unità Filtro microcontrollore in una microcentrifuga a 10.000 xg finché il filtro non è ancora leggermente coperto con del liquido. Solo girare per un breve periodo e controllare ogni minuto se solo una piccola quantità di liquido che resta sul filtro. Per recuperare la tua soluzione di DNA, posto al rialzo filtro verso il basso in una provetta nuova e spin in una seconda fase di centrifugazione a 1000 xg per 3 minuti. Il volume finale non deve superare i 10-15 microlitri in totale, altrimenti il vostro DNA potrebbe essere troppo diluita per la fase di trasformazione.
Nota: non ruotare il dispositivo di filtro troppo lungo e non lasciarlo asciugare completamente per evitare la perdita potenziale campione. Se la membrana è asciutto, aggiungere 10-15 microlitri di acqua sterile sulla membrana, agitare delicatamente per 30 secondi e recuperare il DNA come descritto sopra.
Parte 3: Trasformazione in P. pastoris di elettroporazione
- Il DNA linearizzato e concentrato pPICZαA contenente il tuo inserto è pronto per la trasformazione in electrocompetent P. cellule pastoris (vedi punto I, parte 2). Circa 15 minuti prima della trasformazione preparare i seguenti reagenti e dispositivi: riempire una provetta con 1 ml di 1 M sorbitolo e posizionarlo sul ghiaccio; posto da 0,2 cuvetta elettroporazione cm su ghiaccio; etichetta sterile 15 ml di tubo di vetro e hanno una sterile pipetta Pasteur in vetro a portata di mano.
- Trasferire 80 ml di cellule dalla fase I, parte da 2,7 a una gelida cuvetta 0,2 centimetri elettroporazione. Aggiungere il concentrato linearizzato soluzione di DNA pPICZαA dal punto I, 3,6 e mescolare muovendo la punta della pipetta da lato a lato nella cuvetta elettroporazione.
Nota: quando si aggiunge il DNA solo spingere pipetta alla prima fermata. Dopo la miscelazione con il DNA delle cellule spingere pipetta per la seconda sosta e rimuovere lentamente dalla cuvetta. - Incubare la cuvetta con le cellule in ghiaccio per 5 minuti.
- Pulire l'esterno della cuvetta con un tessuto di impulsi e le cellule secondo i parametri di lievito (Saccharomyces cerevisiae) come suggerito dal produttore della periferica elettroporazione specifico utilizzato.
Nota: si usa una Bio-Rad GenePulser con le seguenti condizioni:- Tensione di carica (V): 1500;
- Capacità (uF): 25;
- Resistenza (Ω): 200.
- Immediatamente aggiungere 1 ml di ghiacciata 1 M sorbitolo alla cuvetta. Trasferire il contenuto cuvetta ad una sterile 15 ml utilizzando il tubo di vetro sterile pipetta Pasteur.
- Lasciate che il tubo di incubare a 30 ° C senza agitazione per 1,5 ore.
- Aggiungere 5-7 perle di vetro sterilizzati in quattro piatti contrassegnati YPDS contenente 100 mg / mL Zeocin. Diffusione 250 microlitri della miscela elettroporazione dal tubo di vetro da 15 ml su ogni piatto. Agitare la piastra orizzontalmente per diffondere uniformemente le celle. Lasciate asciugare la piastra per 15 minuti e poi rimuovere le perle dal agar invertendo la piastra.
Nota: usiamo 100 mg / mL Zeocin selezionare per trasformanti quando si utilizza la GS115 ceppo Pichia. Le condizioni di selezione possono variare se si utilizza un altro ceppo Pichia. - Incubare le piastre a testa in giù per 2 o 3 giorni a 30 ° C fino a formare delle colonie. Avvolgere le piastre in plastica nera per impedire la degradazione del Zeocin sensibile alla luce. Meno quantità di antibiotici nei piatti può portare a falsi cloni positivi.
- Dopo che si sono formate colonie, pick 12 colonie e purificarle strisciando il cloni su fresco piatti YPDS contenente 100 mg / ml di Zeocin.
Fase II: l'espressione della proteina in Pichia pastoris
Per questa fase è necessario avere i seguenti supporti, placche e reagenti a portata di mano:
- BMGY media
- glicerolo, sterilizzato
- BMMY media
- metanolo, sterilizzato
- Epicentro lievito kit di purificazione del DNA
Voibisogno anche i palloni seguenti:
- Matraccio da 250 ml, in autoclave
- Pallone tarato da 1 L sconcertato, autoclave
- Bicchiere da 200 ml, in autoclave
Parte 1: l'espressione della proteina in Pichia pastoris
Tutti i passaggi sono anche eseguiti per il controllo vettoriale trasformato (senza inserto).
- Scegli una singola colonia dalle colonie Pichia purificato dal punto I, 3,9 e inoculare in 25 mL BMGY in una sterile matraccio da 250 ml. Crescono a 30 ° C in un incubatore agitazione (250-300 rpm) fino a quando la cultura raggiunge un diametro esterno 600 = 2-6 (circa 16-18 ore).
Nota: diluire il campione prima di misurare il spettrofotometro in modo da ottenere un risultato preciso. Le cellule saranno in fase di crescita logaritmica. - Quando le cellule hanno raggiunto la appropriato OD 600 preparare uno stock di glicerolo. Trasferire 800 microlitri della cultura 25 mL cellulare per una fiala da 2 ml Corning cyrogenic e aggiungere 200 ml di glicerolo sterilizzato. Congelare il brodo glicerolo e conservare a -80 ° C.
- Lievito per la purificazione del DNA, il trasferimento di 1,5 mL di cultura 25 mL cella a una provetta. Raccogliere le cellule per centrifugazione a 1300 xg per 1 minuto a temperatura ambiente. Queste cellule sono utilizzate per analizzare integrants Pichia per verificare doppio se il gene di interesse si è integrato nel genoma Pichia (vedere il passaggio II, part2). Conservare il pellet a 4 ° C fino a quando ulteriori analisi.
- Trasferire il resto della cultura di 25 mL in una provetta da 50 ml Falcon e raccogliere le cellule per centrifugazione a 3000 xg per 5 minuti a temperatura ambiente. Decantare il surnatante e posizionare i tubi a testa in giù su un tessuto di rimuovere il media residua. Per lavare il pellet di cellule che BMMY risospendere in 20 ml di rimuovere qualsiasi mezzo rimanenti BMGY, come glicerolo dal mezzo BMGY può inibire l'espressione più tardi. Centrifuga di nuovo a 3000 xg per 5 minuti a temperatura ambiente e decantare il surnatante.
- Risospendere il pellet cellulare ad un diametro esterno 600 di 1,0 in media BMMY di indurre l'espressione (circa 100-200 ml) e trasferire la cultura in un pallone di 1 litro sconcertato. Coprire il recipiente con un bicchiere da 200 ml e tornare a incubatore di continuare la crescita a 30 ° C.
Nota: è importante che la temperatura non supera i 30 ° C. Se la temperatura del vostro oscilla incubatore, impostare la temperatura a 28 ° C. Aerazione adeguata è anche un parametro importante per l'espressione efficace durante l'induzione metanolo (quando si induce l'espressione, non superare mai un volume cultura> 10-30% del volume totale fiasco). Si consiglia l'uso di palloni sconcertati, in quanto introducono più ossigeno nei terreni di coltura. - Aggiungi sterilizzati metanolo puro ad una concentrazione finale di 0,5% di metanolo ogni 24 ore per mantenere induzione.
- A tempi determinati dopo l'inizio dell'espressione trasferire 1 mL della coltura in una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml. Centrifugare a 1300 xg per 2.5 minuti a temperatura ambiente. Trasferire il supernatante in una parte del tubo 1,5 ml microcentrifuga. Conservare il pellet supernatante e cellulari a -80 ° C fino a quando ulteriori analisi. I campioni provenienti da diversi momenti saranno analizzati per stabilire la durata ottimale per l'espressione delle proteine dopo l'induzione.
Nota: abbiamo scelto 6h, 12h, 24h, 36h e 48h, come i punti di tempo per prendere i campioni. Un'ulteriore crescita fino a 4 giorni è possibile. I punti di tempo ottimale varia tra le diverse proteine espresse. - Analizzare i supernatanti e pellet cellulari per l'espressione delle proteine da Coomassie macchiati di SDS-PAGE e Western Blot (non descritto in questo protocollo).
Parte 2: Lievito di purificazione del DNA e analisi PCR dei integrante Pichia
Tutti i reagenti necessari per la fase di purificazione del DNA del lievito della cultura in Pichia BMGY sono inclusi nel kit di purificazione del DNA MasterPure lievito da Epicentre.
Nota: questa analisi è aggiuntivo e viene eseguito per determinare se il gene di interesse ha integrato nel genoma Pichia. Il pellet di cellule da un campione di 1,5 ml presi dalla cultura in BMGY (vedi punto II, parte 1.3) è utilizzato.
Seguire le istruzioni del manuale lievito Epicentre MasterPure purificazione del DNA ed eseguire una PCR con il DNA di lievito con primer specifici per l'inserimento. 3 ml di analizzare il prodotto di PCR su un gel contenente 1 microlitri bromuro di etidio. Includono una Kb 1 Dimensioni + marca in un pozzetto di interpretare la dimensione del vostro inserimento e visualizzare il DNA utilizzando una stazione di gel documentazione.
La proteina ricombinante può essere analizzato attraverso l'analisi western blot. Purificazione di proteine può essere eseguito da purificazione His-tag su metallo carica di resina (non descritte in questo protocollo).
Appendice, l'elenco delle ricette
Fase I:
- YPD medio:
Per preparare 600 mLdi media YPD (estratto di lievito peptone destrosio Medium) sciogliere 5 g di estratto di lievito e 12 g di peptone in 540 ml di acqua. Autoclave per 20 minuti su ciclo liquido.
Nel frattempo preparare 70 ml di destrosio al 20% e filtro-sterilizzare prima dell'uso.
Lasciate raffreddare la soluzione sterilizzati in autoclave a 60 ° C e aggiungere 60 ml di sterilizzata per filtrazione, destrosio 20%. - YPDS (+ Zeocin) piastre:
Per preparare 500 ml di YPDS + agar Zeocin (Estratto di Lievito peptone Media destrosio, sorbitolo) sciogliere 5 g di estratto di lievito, 91,1 g di peptone sorbitolo e 10 g in 450 ml di acqua. Aggiungere 10 g di agar e una ancoretta magnetica e autoclave per 20 minuti a ciclo liquido.
Nel frattempo preparare 60 ml di destrosio al 20% e filtro-sterilizzare prima dell'uso.
Lasciate raffreddare la soluzione sterilizzati in autoclave a 60 ° C, aggiungere 50 ml di sterilizzata per filtrazione, destrosio 20%.
Versare pochi piatti prima di aggiungere l'antibiotico per piatti YPDS senza Zeocin. Quindi aggiungere 500 microlitri Zeocin da 100 mg / ml di soluzione concentrata per ottenere una concentrazione finale di 100 mg / ml Zeocin in agar. Lasciate mescolare in un piatto magnetico quando si aggiunge l'antibiotico e lasciate mescolare per circa altri 2 minuti per mescolare allo stesso modo.
Versare media in piastre di Petri e coprire con plastica nera. Lasciate asciugare le piastre sul banco durante la notte. Conservare le piastre contenenti YPD Zeocin a 4 ° C. Il periodo di conservazione è una o due settimane.
Nota: la copertura con la plastica è necessario perché Zeocin è sensibile alla luce.
Fase II:
- BMGY (glicerolo-Buffered complesso Medium) e BMMY (Buffered Metanolo complesso Medium):
Sciogliere per ogni media 8 g di estratto di lievito e 16 g di peptone in 560 ml di acqua. Autoclave per 20 minuti su ciclo liquido.
Nel frattempo preparare le seguenti soluzioni:- 1 M tampone fosfato di potassio, pH 6,0:
- 10X YNB (13,4% lievito di base azoto con solfato di ammonio senza aminoacidi):
- 500X B (0,02% Biotina):
- 10X M (5% Metanolo):
- GY 10 volte (10% glicerolo):
Lasciate che la soluzione sterilizzati in autoclave a temperatura ambiente, quindi aggiungere il seguente e mescolare bene:- 80 ml 1 M tampone fosfato di potassio, pH 6,0;
- 80 ml YNB 10X
- 0,16 ml 500X B
- GY 80 ml 10X
Conservare i supporti a 4 ° C. La durata di conservazione di questa soluzione è di circa due mesi.
Rappresentante Risultati
Figura 1. Western Blot Questa immagine mostra quattro proteine espresse (etichettato come 1605, 0537, 1228 e 1682) dopo 24 ore di espressione. L'anticorpo utilizzato per immunoblotting era un c-myc HRP-anticorpo. La seconda corsia (etichettato N) è un controllo negativo ed è stato caricato con sopranatante dalle cellule che non esprimono una proteina ricombinante, perché sono stati trasformati con il genitore (liscio) vettoriale.
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Discussion
Espressione della proteina usando il methylotrophic Pichia pastoris lievito come sistema host è descritto in questo protocollo. La proteina può essere secreta nel mezzo a seconda del vettore di clonazione utilizzata. La secrezione della proteina ricombinante rende più facile la successiva purificazione. Tuttavia, le condizioni indicate possono essere ottimizzati per l'espressione di proteine diverse e cambiamenti nelle condizioni e tempi di espressione può portare a livelli di proteine maggiore. Il vettore utilizzato in questo protocollo ha la caratteristica di un c-myc epitopo e un anticorpo per questo epitopo può essere acquistato. Questo permette l'analisi delle proteine per le quali non ci sono anticorpi ancora disponibile. La funzione di His-tag del vettore genitore facilita la purificazione di proteine su metallo-chelante resina e vi è anche un anticorpo per la sezione His-tag del vettore disponibile.
Come descritto in questo protocollo, l'espressione della proteina in Pichia pastoris è un processo a più fasi, che deve essere ben pianificato e preparato. Un tempo di 2-3 settimane è necessario per eseguire tutti i passaggi, ma escludendo la clonazione del costrutto con il gene di interesse. La base per la trasformazione di successo in P. pastoris è alta la trasformazione delle cellule di lievito efficiente e competente un costrutto linearizzato che può integrarsi nel genoma del lievito. Western blot e His-tag purificazione sono applicazioni per determinare il livello di espressione della proteina ricombinante e sono i prossimi passi da eseguire dopo questo protocollo.
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Acknowledgments
Vorremmo ringraziare la Fondazione canadese per l'innovazione, la British Columbia Fondo di conoscenza per lo sviluppo e la Canadian Institutes of Health Research (CIHR) per sostenere questo lavoro. MT è stato sostenuto da una borsa di studio del Centro TULA fondazione finanziata per la diversità microbica e Evolution (CMDE).
References
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- Cregg, J. M., Barringer, K. J., Hessler, A. Y. Pichia pastoris as a Host System for Transformations. Mol. Cell. Biol. 5, 3376-3385 (1985).
- Cregg, J. M., Cereghino, J. L., Shi, J., Higgins, D. R.
- Cereghino, G. P., Cereghino, J. L., Ilgen, C., Cregg, J. M. Production of recombinant proteins in fermenter cultures of the yeast Pichia pastoris. Curr Opin Biotechnol. 4, 329-332 (2002).
