Summary
Le protocole décrit l'expression de protéines en utilisant la levure méthylotrophique
Abstract
L'expression des protéines microbiennes dans le pastoris hôte eucaryote Pichia offre la possibilité de générer de grandes quantités de protéine recombinante dans un système d'expression rapide et facile à utiliser.
En tant que P. unicellulaires microorganisme pastoris est facile à manipuler et se développe rapidement sur un support peu coûteux à de fortes densités cellulaires. Être un eucaryote, P. pastoris est capable d'effectuer de nombreuses modifications post-traductionnelles effectuées par des cellules eucaryotes supérieures et les protéines recombinantes obtenues subissent le repliement des protéines, le traitement protéolytique, formation de ponts disulfures et de glycosylation [1].
Comme une levure méthylotrophe P. pastoris est capable de métaboliser le méthanol comme seule source de carbone. Le promoteur fort pour l'alcool oxydase, AOX1, est strictement réglementée et induite par le méthanol et il est utilisé pour l'expression du gène d'intérêt. En conséquence, l'expression de la protéine étrangère peut être induite par addition de méthanol au milieu de croissance [2, 3].
Un autre avantage important est la sécrétion de la protéine recombinante dans le milieu de croissance, en utilisant une séquence signal pour cibler la protéine étrangère à la voie de sécrétion de P. pastoris. Avec seulement un faible niveau de protéine endogène sécrétée à la presse par la levure elle-même et pas de protéines ajouté aux médias, une protéine hétérologue construit la majorité des protéines totales dans le milieu et facilite les étapes suivantes de purification des protéines [3, 4].
Le vecteur utilisé ici (pPICZαA) contient le promoteur pour AOX1 étroitement réglementé, le méthanol induit l'expression du gène d'intérêt, le signal de sécrétion du facteur α de la sécrétion de la protéine recombinante, un gène de résistance à la zéocine pour la sélection dans les deux E. coli et Pichia et un peptide C-terminal contenant l'épitope c-myc et une polyhistidine (6xHis) tag pour la détection et la purification d'une protéine recombinante. Nous montrons aussi une analyse Western blot de la protéine recombinante en utilisant les anticorps spécifiques anti-myc-HRP anticorps reconnaissant l'épitope c-myc sur le vecteur parent.
Protocol
L'expression de protéines recombinantes dans la levure Pichia pastoris méthylotrophes
Avant de commencer ce protocole, vous devez avoir votre gène d'intérêt cloné dans le châssis dans un p. vecteur parent pastoris et l'ont séquencé pour vérifier l'insertion correcte du gène d'intérêt dans le vecteur.
Etape I: Générer des cellules de levure électrocompétentes, la linéarisation de la construction et de transformation en P. pastoris
Pour cette étape, vous aurez besoin d'avoir les médias suivants et les plaques à portée de main:
- Plaques YPDS
- 600 ml milieu YPD
- glacée de l'eau stérile
- 1 M de sorbitol
- Amicon Ultra-4 dispositif centrifuge Filtre
- Microcon YM-30 Unité centrifuge Filtre
- 0,2 cm électroporation cuvette
- Tube de 15 ml en verre stérile
- stériles pipette Pasteur en verre
- Plaques contenant YPDS Zéocine
Partie 1: Préparation des cellules de levure électrocompétentes
- Quatre jours avant la séquence de transformation destiné à P. cellules pastoris sur une plaque YPDS sans Zéocine et les laisser pousser une 30 ° C pendant 1-2 jours ou jusqu'à ce que la forme des colonies isolées.
- Deux jours avant la transformation destinée croissance de 5 ml de votre P. souche pastoris en milieu YPD dans un tube Falcon de 50 ml à 30 ° C pendant la nuit. Placer le tube Falcon dans un flacon pour le fixer dans le shaker.
- Le jour avant la transformation inoculer 500 ml de milieu YPD frais dans un ballon de 2 litres avec 0,25 mL de la culture de la nuit et de laisser pousser à nouveau la nuit dans un shaker à 30 ° C à une DO 600 = 1.3 à 1.5.
Remarque: diluer l'échantillon avant la mesure sur le spectrophotomètre afin que vous obteniez un résultat précis. - Le jour de la transformation ont de l'eau glacée stérile et sorbitol 1 M à portée de main. Centrifuger les cellules à 1500 xg pendant 5 minutes à 4 ° C. Reprendre le culot avec 500 ml de glace-froid, l'eau stérile.
- Centrifuger les cellules à nouveau comme l'étape 4. Reprendre le culot avec 250 ml de glace-froid, l'eau stérile.
- Centrifuger les cellules à nouveau comme dans l'étape 4. Reprendre le culot dans 20 mL d'glacée sorbitol 1 M.
- Centrifuger les cellules à nouveau comme dans l'étape 4. Reprendre le culot dans 1 ml de glace froide sorbitol 1 M à un volume final de ~ 1,5 ml. Stocker les piles sur la glace ou à 4 ° C jusqu'à utilisation ultérieure.
Remarque: nous préparons les cellules plus électrocompétentes que nécessaire et les stocker dans des aliquotes de 80 pl dans des microtubes à -80 ° C. Nous utilisons les cellules stockées pour plus d'un mois.
Partie 2: Linéarisation et la concentration de la construction pPICZαA
Pour la transformation linéariser le vecteur contenant votre gène d'intérêt par la digestion de restriction. Nous utilisons les Pmel enzyme. Autres sites de restriction sont possibles. Vous devez vous assurer que votre insert ne contient pas le site de restriction que vous voulez utiliser pour linéariser votre vecteur. Pour la transformation en P. pastoris vous aurez besoin de 50 à 20 pg d'ADN linéarisé de 50 à 10 de l'eau stérile ul.
Aussi linéariser, le concentré et le transfert du vecteur clair (pas d'insertion) dans P. pastoris. Le vecteur parent sans l'insert est un contrôle de l'expression intracellulaire de fond et vous permet d'interpréter les résultats de votre expression.
- Décongeler tous les réactifs sur la glace, mélanger les réactifs suivants et centrifuger brièvement le tube pour obtenir tout le liquide vers le bas, appuyez sur le tube et le spin de nouveau:
- x de l'eau stérile, ul
- 5.0 4 pl NEBuffer 10X
- 0,5 ul 100X BSA
- jusqu'à 2 mg ADN vecteur (~ 100 ng / uL)
- 2,0 ul mélange d'enzymes Pme I
Remarque: pour obtenir suffisamment d'ADN vecteur linéarisé préparer le mélange ci-dessus 3 ou 4 fois dans des tubes séparés et de combiner les solutions lorsque la concentration des ADN digérés par Amicon Ultra dispositif centrifuge. - Incuber à 37 ° C pendant 3 heures et la chaleur inactiver le mélange enzymatique à 65 ° C pendant 20 minutes.
- Dans le même temps de pré-rinçage Amicon Ultra-4 dispositif centrifuge filtre avec 1 ml d'eau Milli-Q, le spin le tube à 4000 xg pendant 6-8 minutes et jeter le débit à travers.
Remarque: ne pas laisser la membrane sécher une fois mouillé. Si vous n'utilisez pas l'appareil après le pré-rinçage, laissez l'eau sur la membrane jusqu'à ce que l'appareil est utilisé. - Transférer la solution inactivée par la chaleur de l'étape 2 à l'unité de pré-rinçage Amicon filtre centrifuge, tourner les tubes à 4000 xg pendant 6-8 minutes et jeter le débit à travers.
Remarque: si vous avez préparé plus d'un mélange de linéarisation, combiner toutes les solutions en une seule unité de filtrage Amicon centrifuge. - Centrifuger jusqu'à ce que la quantité de solution sur le filtre Amicon est réduite à environ 100 ~ 150 m &u; l. Ajouter un autre 1,5 ml d'eau stérile pour le tube vide en haut et transférer la solution dans le tube Amicon et répétez l'étape de centrifugation. Laver une deuxième fois avec 1,5 mL d'eau stérile et jeter traversent à nouveau. Réduire le volume final à ~ 150 pl. Les étapes de lavage enlever le sel restant de la mémoire tampon pour empêcher arche où pulsant les cellules.
Remarque: nous utilisons un rotor swing pour l'étape de centrifugation; suffit de placer le Amicon plafonné centrifuges unité de filtre dans un tube Falcon de 50 ml pour le maintenir en place pendant la centrifugation. Amicon dispositifs de filtrage conserver 50 ul de la solution sur le filtre même après centrifugation prolongée. - Pour une plus grande concentration de la préparation de l'ADN de transfert de la solution d'ADN restants du dispositif de filtre Amicon à un Microcon préalablement rincé YM-30 Unité centrifuge filtre et rincer le tube Amicon avec un supplément de 50 ul d'eau stérile pour récupérer tout l'ADN. Centrifuger les Microcon Unité centrifuge filtre dans une microcentrifugeuse à 10.000 xg jusqu'à ce que le filtre est toujours légèrement recouvert de liquide. Seuls spin pour une courte période et vérifier toutes les minutes si seulement une petite quantité de liquide est laissé sur le filtre. Pour récupérer votre solution d'ADN, placez le filtre vers le bas à l'envers dans un nouveau tube et de spin dans une étape de centrifugation seconde à 1000 xg pendant 3 minutes. Le volume final ne doit pas dépasser 10 à 15 ul au total, sinon votre ADN pourrait être trop diluée pour l'étape de transformation.
Note: ne pas tourner le dispositif de filtrage trop long et laissez-le sécher complètement pas à prévenir la perte de l'échantillon potentiel. Si votre membrane est sèche, ajouter l'eau de 10 à 15 ul stériles sur la membrane, agiter doucement pendant 30 secondes et récupérer votre ADN tel que décrit ci-dessus.
Partie 3: Transformation en P. pastoris par électroporation
- L'ADN linéarisé et concentré pPICZαA contenant votre insert est maintenant prêt pour la transformation dans le électrocompétentes P. cellules pastoris (voir l'étape I, partie 2). Environ 15 minutes avant la transformation de préparer les réactifs et les dispositifs suivants: remplir un microtube avec 1 ml de sorbitol 1 M et le placer sur la glace, et place une cuvette d'électroporation de 0,2 cm sur la glace; l'étiquette d'un tube de verre stériles de 15 mL et ont une solution stérile pipette Pasteur en verre à portée de main.
- Transfert 80 ul des cellules de l'étape I, partie 2.7 pour une glacée 0,2 cm cuvette d'électroporation. Ajouter la solution concentrée ADN linéarisé pPICZαA partir de l'étape I, partie 3.6 et mélanger en déplaçant la pointe de la pipette d'un côté à côte dans la cuvette d'électroporation.
Remarque: lors de l'ajout de l'ADN que pousser pipette pour le premier arrêt. Après le mélange de l'ADN avec les cellules poussent pipette pour le deuxième arrêt et retirer lentement de la cuvette. - Incuber la cuvette avec les cellules sur la glace pendant 5 minutes.
- Essuyez l'extérieur de la cuvette avec un tissu et d'impulsion des cellules selon les paramètres de la levure (Saccharomyces cerevisiae) comme suggéré par le fabricant du dispositif d'électroporation spécifique utilisé.
Remarque: nous utilisons un GenePulser Bio-Rad avec les conditions suivantes:- La tension de charge (V): 1500;
- Capacité (uF): 25;
- Résistance (Ω): 200.
- Immédiatement ajouter 1 mL d'glacée sorbitol 1 M dans la cuvette. Transférer le contenu cuvette à un tube de 15 ml stériles à l'aide de la pipette Pasteur en verre stériles.
- Laissez incuber le tube à 30 ° C sans agitation pendant 1,5 heures.
- Ajouter 5-7 perles de verre stérilisés sur quatre assiettes YPDS étiquetés contenant 100 ug / ml zéocine. Fais 250 pi du mélange électroporation dans le tube en verre de 15 ml sur chaque assiette. Agiter la plaque horizontale d'une répartition régulière sur les cellules. Laissez la plaque sécher pendant 15 minutes puis enlever les perles de l'agar en inversant la plaque.
Remarque: nous utilisons 100 pg / mL Zéocine pour sélectionner les transformants en utilisant la souche de Pichia GS115. Les conditions de sélection peut varier si vous utilisez une autre souche de Pichia. - Incuber les boîtes à l'envers pendant 2 à 3 jours à 30 ° C jusqu'à former des colonies. Envelopper les plaques dans un plastique noir pour éviter la dégradation de l'Zéocine sensible à la lumière. Moins quantité d'antibiotique dans les plaques peut entraîner des fausses clones positifs.
- Après les colonies se sont formées, ramasser 12 colonies et de les purifier par stries sur les clones frais plaques YPDS contenant 100 ug / ml de zéocine.
Etape II: L'expression des protéines dans Pichia pastoris
Pour cette étape, vous aurez besoin d'avoir les médias suivants, les plaques et les réactifs à portée de main:
- Moyennes BMGY
- glycérol, stérilisés
- Moyennes BMMY
- méthanol, stérilisé
- Levure EPICENTRE kit de purification d'ADN
Vouségalement besoin des flacons suivants:
- Flacon de 250 ml, autoclave
- 1 flacon L dérouté, autoclavés
- 200 ml bécher, autoclavés
Partie 1: L'expression des protéines dans Pichia pastoris
Toutes les étapes suivantes sont aussi effectuées pour le contrôle des vecteurs transformés (sans insert).
- Choisissez une seule colonie des colonies Pichia purifiée de l'étape I, partie 3.9 et inoculer dans 25 ml BMGY dans un flacon de 250 ml stériles. Croître à 30 ° C dans un incubateur agitateur (250-300 tpm), jusqu'à la culture atteint une DO 600 = 2-6 (environ 16-18 heures).
Remarque: diluer l'échantillon avant la mesure sur le spectrophotomètre afin que vous obteniez un résultat précis. Les cellules seront en phase logarithmique de croissance. - Lorsque les cellules ont atteint la DO 600 appropriés préparer un stock de glycérol. Transfert 800 ul de la culture de 25 ml de cellules à un flacon de 2 ml Corning cryogénique et ajouter 200 ul de glycérol stérilisé. Congelez le stock de glycérol et de stocker à -80 ° C.
- Pour la purification d'ADN de levure, le transfert de 1,5 mL de la culture de 25 ml de cellules dans un tube à centrifuger. Récolter les cellules par centrifugation à 1300 xg pendant 1 minute à température ambiante. Ces cellules sont utilisées pour analyser les intégrants Pichia de revérifier si le gène d'intérêt est intégré dans le génome de Pichia (voir l'étape II, partie 2). Stocker le culot cellulaire à 4 ° C jusqu'à l'analyse plus loin.
- Transférer le reste de la culture 25 ml d'un tube Falcon de 50 ml et de récolter les cellules par centrifugation à 3000 xg pendant 5 minutes à température ambiante. Décanter le surnageant et placer les tubes à l'envers sur un papier-mouchoir pour enlever n'importe quel média résiduel. Pour laver le culot cellulaire c'est remettre en suspension dans 20 ml BMMY de supprimer tout support BMGY restants, comme le glycérol dans le milieu BMGY peut inhiber l'expression plus tard. Centrifuger de nouveau à 3000 xg pendant 5 minutes à température ambiante et décanter le surnageant.
- Resuspendre le culot cellulaire à une DO 600 de 1,0 en milieu BMMY pour induire l'expression (environ 100-200 ml) et le transfert de la culture dans un flacon de 1 litre dérouté. Couvrir la fiole avec un bécher de 200 ml et le retour à l'incubateur de continuer la croissance à 30 ° C.
Remarque: il est important que la température ne dépasse pas 30 ° C. Si la température de votre fluctue incubateur, régler la température à 28 ° C. Une aération adéquate est également un paramètre important pour l'expression efficace lors de l'induction du méthanol (quand induction de l'expression, ne jamais dépasser un volume de culture> 10-30% de votre volume flacon au total). Nous recommandons fortement l'utilisation de flacons déconcertés, car ils introduisent plus d'oxygène dans les milieux de culture. - Ajouter stérilisés méthanol pur à une concentration finale de méthanol 0,5% toutes les 24 heures pour maintenir l'induction.
- Au point certain temps après le début du transfert de l'expression de 1 mL de la culture à un tube de 1,5 ml. Centrifuger à 1300 xg pendant 2,5 minutes à température ambiante. Transférer le surnageant dans un microtube séparée 1,5 mL. Stocker les boulettes surnageant et des cellules à -80 ° C jusqu'à l'analyse plus loin. Les échantillons provenant de différents points de temps seront analysées pour établir la période de temps optimal pour l'expression des protéines après l'induction.
Remarque: nous choisissons 6h, 12h, 24h, 36h et 48h que les points de temps pour prendre des échantillons. Poursuite de la croissance jusqu'à 4 jours est possible. Les points de moment optimal varie entre les différentes protéines exprimées. - Analyser les surnageants et les culots cellulaires pour l'expression protéique par Coomassie teinté SDS-PAGE et Western blot (non décrite dans ce protocole).
Partie 2: purification de l'ADN de levure et d'analyse par PCR des intégrants Pichia
Tous les réactifs nécessaires à l'étape de purification d'ADN de la levure de la culture de Pichia dans BMGY sont inclus dans le kit de purification d'ADN de levure MasterPure d'Epicentre.
Remarque: cette analyse est supplémentaire et est effectuée pour déterminer si le gène d'intérêt est intégré dans le génome de Pichia. Le culot cellulaire à partir d'un échantillon de 1,5 mL prises de la culture dans BMGY (voir l'étape II, partie 1.3) est utilisé.
Suivez les instructions du manuel Epicentre levure MasterPure purification d'ADN et d'exécuter un PCR avec l'ADN de la levure avec des amorces spécifiques pour l'insérer. Analyser 3 ul de votre produit de PCR sur un gel d'agarose contenant du bromure d'éthidium 1 pl. Inclure un marqueur de taille 1 Ko + dans un puits d'interpréter la taille de votre insérer et visualiser l'ADN en utilisant une station de documentation de gel.
La protéine recombinante peut être analysé par Western blot. Purification des protéines peut être effectuée par une purification His-tag sur le métal chargée de résine (non décrite dans ce protocole).
Annexe, liste des recettes
Etape I:
- Milieu YPD:
Pour préparer 600 mlde milieu YPD (extrait de levure peptone dextrose Medium) dissoudre extrait de levure 5 g et 12 g de peptone dans 540 ml d'eau. Autoclave pendant 20 minutes sur le cycle liquide.
Dans le même temps de préparer 70 ml de dextrose 20% et un filtre-stériliser avant utilisation.
Laisser la solution refroidir à l'autoclave à 60 ° C et ajouter 60 ml d'stérilisée par filtration de dextrose à 20%. - YPDS (+ Zéocine) plaques:
Pour préparer 500 ml de YPDS + agar Zéocine (extrait de levure peptone dextrose moyenne avec sorbitol) dissoudre extrait de levure 5 g, 91,1 g de peptone de sorbitol et 10 g dans 450 ml d'eau. Ajouter 10 g de gélose et un agitateur magnétique et autoclaver pendant 20 minutes sur le cycle liquide.
Dans le même temps de préparer 60 ml de dextrose 20% et un filtre-stériliser avant utilisation.
Laisser la solution refroidir à l'autoclave à 60 ° C, ajouter 50 ml de dextrose, stérilisée par filtration à 20%.
Verser quelques assiettes avant d'ajouter l'antibiotique pour les plaques YPDS sans zéocine. Puis ajouter 500 ul d'une Zéocine 100 mg / ml de solution concentrée pour obtenir une concentration finale de 100 pg / ml Zéocine dans l'agar. Laissez brasser sur un plateau magnétique lors de l'ajout de l'antibiotique et laissez remuez pendant environ 2 minutes de plus au même mélange.
Verser les médias en boîtes de Petri et les couvrir avec du plastique noir. Laissez les plaques sèches sur le banc durant la nuit. Plaques magasin YPD contenant Zéocine à 4 ° C. La durée de vie est une à deux semaines.
Remarque: la couverture avec le plastique est nécessaire parce Zéocine est sensible à la lumière.
Etape II:
- BMGY (Glycérol tamponné complexe Medium) et BMMY (Methanol-Buffered complexes moyenne):
Dissoudre pour chaque support de 8 g d'extrait de levure et 16 g de peptone dans 560 ml d'eau. Autoclave pendant 20 minutes sur le cycle liquide.
Dans le même temps préparer les solutions suivantes:- 1 M de tampon phosphate de potassium, pH 6,0:
- 10X YNB (13,4% de base azotée de levure au sulfate d'ammonium sans acides aminés):
- 500X B (0,02% biotine):
- 10X M (5% de méthanol):
- GY 10X (10% de glycérol):
Laissez la solution autoclave refroidir à température ambiante, puis ajoutez la ligne suivante et bien mélanger:- 80 mL 1 M de tampon phosphate de potassium, pH 6,0;
- 80 ml YNB 10X
- 0,16 ml 500X B
- 80 ml GY 10X
Conservez les supports à 4 ° C. La durée de vie de cette solution est d'environ deux mois.
Les résultats représentatifs
Figure 1. Cette image Western blot montre quatre protéines exprimées (étiqueté comme 1605, 0537, 1228 et 1682) après 24 heures d'expression. L'anticorps utilisé pour immunoblot était un anticorps c-myc-HRP. La deuxième voie (marqué N) est un contrôle négatif et a été chargé avec le surnageant des cellules qui n'expriment pas une protéine recombinante, parce qu'ils ont été transformées avec le parent (ordinaire) du vecteur.
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Discussion
L'expression des protéines à l'aide de la levure méthylotrophe Pichia pastoris comme un système hôte est décrite dans ce protocole. La protéine peut être sécrété dans le milieu en fonction du vecteur de clonage utilisé. La sécrétion de la protéine recombinante permet la purification ultérieure plus facile. Toutefois, les conditions indiquées peuvent être optimisés pour l'expression de différentes protéines et les changements dans les conditions et les délais d'expression peut entraîner des niveaux de protéine accrue. Le vecteur utilisé dans ce protocole a la particularité d'un épitope c-myc et un anticorps pour cet épitope peut être acheté. Cela permet l'analyse des protéines pour lesquelles il n'existe pas encore disponibles anticorps. La fonction de His-tag du vecteur parent facilite la purification de protéines sur les chélateurs de métaux de résine et il ya aussi un anticorps pour la section His-tag du vecteur disponibles.
Comme décrit dans ce protocole, l'expression des protéines dans Pichia pastoris est un multi-processus qui doit être bien planifiée et préparée. Un temps de deux à trois semaines est nécessaire pour effectuer toutes les étapes, mais excluant le clonage de la construction avec le gène d'intérêt. La base pour la transformation réussie dans P. pastoris sont élevés transformation efficace des cellules de levure compétents et une construction linéarisé qui peut s'intégrer dans le génome de la levure. Western blot et son tag de purification sont des applications pour déterminer le niveau d'expression de protéines recombinantes et sont les prochaines étapes à effectuer après ce protocole.
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Acknowledgments
Nous tenons à remercier la Fondation canadienne pour l'innovation, le Fonds de développement des connaissances en Colombie-Britannique, et les Instituts canadiens de recherche en santé du Canada (IRSC) pour soutenir ce travail. MT a été soutenue par une bourse de la Fondation du Centre TULA financé pour la diversité microbienne et évolution (cmde).
References
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- Cregg, J. M., Barringer, K. J., Hessler, A. Y. Pichia pastoris as a Host System for Transformations. Mol. Cell. Biol. 5, 3376-3385 (1985).
- Cregg, J. M., Cereghino, J. L., Shi, J., Higgins, D. R. Recombinant protein expression in Pichia pastoris. Mol Biotechnol. 16, 23-52 (2000).
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