पुनः संयोजक प्रोटीन के Methylotrophic खमीर में अभिव्यक्ति Pichia pastoris Published: February 25, 2010 doi: 10.3791/1862

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Maria Weidner¹, Marcus Taupp¹, Steven J. Hallam¹

¹Department of Microbiology and Immunology, University of British Columbia - UBC

Summary

प्रोटोकॉल methylotrophic खमीर का उपयोग प्रोटीन अभिव्यक्ति का वर्णन

Abstract

माइक्रोबियल यूकेरियोटिक मेजबान Pichia pastoris में प्रोटीन की अभिव्यक्ति के लिए एक तेज और आसान उपयोग करने के लिए अभिव्यक्ति प्रणाली में पुनः संयोजक प्रोटीन की उच्च मात्रा में उत्पन्न की संभावना प्रदान करता है.

के रूप में एक एकल celled सूक्ष्मजीव पी. pastoris हेरफेर करने के लिए आसान है और उच्च सेल घनत्व में सस्ती मीडिया पर तेजी से बढ़ता है . एक eukaryote, पी. होने के नाते pastoris बाद translational संशोधनों उच्च यूकेरियोटिक कोशिकाओं और पुनः संयोजक प्रोटीन प्राप्त द्वारा प्रदर्शन के कई प्रोटीन तह, proteolytic प्रसंस्करण, डाइसल्फ़ाइड बांड गठन और [1] ग्लाइकोसिलेशन से गुजरना करने के लिए प्रदर्शन करने में सक्षम है.

के रूप में एक methylotrophic खमीर पी. pastoris अपने एकमात्र कार्बन स्रोत के रूप में मेथनॉल metabolizing के लिए सक्षम है . शराब oxidase, AOX1, के लिए मजबूत प्रमोटर कसकर विनियमित है और मेथनॉल से प्रेरित है और यह हित के जीन की अभिव्यक्ति के लिए प्रयोग किया जाता है. तदनुसार, मध्यम विकास के लिए मेथनॉल जोड़कर विदेशी प्रोटीन की अभिव्यक्ति प्रेरित किया जा सकता है [2, 3].

एक अन्य महत्वपूर्ण लाभ मध्यम विकास में पुनः संयोजक प्रोटीन का स्राव है, एक संकेत अनुक्रम का उपयोग कर पी. pastoris की स्रावी मार्ग विदेशी प्रोटीन लक्ष्य. अंतर्जात खमीर ही मीडिया के लिए secreted प्रोटीन और मीडिया को नहीं जोड़ा प्रोटीन का ही निम्न स्तर के साथ, एक heterologous प्रोटीन मध्यम में कुल प्रोटीन के बहुमत बनाता है और प्रोटीन शुद्धि चरणों का पालन की सुविधा [3, 4].

α कारक पुनः संयोजक प्रोटीन, दोनों ई. में एक Zeocin चयन के लिए प्रतिरोध जीन के स्राव के लिए स्राव संकेत; यहां इस्तेमाल किया वेक्टर (pPICZαA) कसकर विनियमित, मेथनॉल प्रेरित हित के जीन की अभिव्यक्ति के लिए AOX1 प्रमोटर शामिल कोलाई और Pichia और सी टर्मिनल पेप्टाइड युक्त सी Myc मिलान और पता लगाने और एक पुनः संयोजक प्रोटीन की शुद्धि के लिए एक polyhistidine टैग (6xHis) . हम भी विशिष्ट विरोधी myc-एचआरपी माता पिता वेक्टर पर मिलान सी Myc पहचानने एंटीबॉडी का उपयोग करते हुए पुनः संयोजक प्रोटीन के पश्चिमी धब्बा विश्लेषण दिखाते हैं.

Protocol

पुनः संयोजक प्रोटीन के methylotrophic खमीर Pichia pastoris में अभिव्यक्ति

इससे पहले कि आप इस प्रोटोकॉल शुरू आप अपने हित के जीन एक पी. में फ्रेम में क्लोन होना चाहिए pastoris माता पिता वेक्टर और यह वेक्टर में ब्याज की जीन के सही प्रविष्टि के लिए जाँच करने के लिए अनुक्रम है.

मैं कदम: उत्पन्न electrocompetent खमीर कोशिकाओं का निर्माण और पी. में परिवर्तन के linearization pastoris

इस कदम के लिए आप के हाथ में निम्नलिखित मीडिया और प्लेट की आवश्यकता होगी:

• YPDS प्लेटें
• 600 एमएल YPD मध्यम
• ठंडा बाँझ पानी
• 1 sorbitol एम
• Amicon केन्द्रापसारक फ़िल्टर डिवाइस 4 अल्ट्रा
• Microcon YM 30 केन्द्रापसारक फ़िल्टर यूनिट
• 0.2 सेमी electroporation क्युवेट
• 15 एमएल बाँझ ग्लास ट्यूब
• बाँझ कांच पाश्चर पिपेट
• YPDS Zeocin युक्त प्लेटें

भाग 1: electrocompetent खमीर कोशिकाओं की तैयारी

1. चार दिन पहले इरादा पी. बाहर परिवर्तन लकीर Zeocin बिना एक YPDS थाली पर pastoris कोशिकाओं और उन्हें 1-2 दिनों के लिए या एकल कालोनियों फार्म जब तक एक 30 डिग्री सेल्सियस बढ़ने .
2. इरादा परिवर्तन के दो दिन पहले अपने पी. के 5 मिलीलीटर बढ़ने pastoris तनाव YPD मध्यम में एक 50 मिलीलीटर फाल्कन ट्यूब में 30 डिग्री सेल्सियस रातोंरात. एक कुप्पी में फाल्कन ट्यूब प्लेस प्रकार के बरतन में तय है.
3. रातोंरात संस्कृति के 0.25 एमएल और एक प्रकार के बरतन में रात फिर 30 से बढ़ने ° एक आयुध डिपो ₆₀₀ 1.3-1.5 = सी के साथ एक 2 लीटर फ्लास्क में परिवर्तन टीका लगाना ताजा YPD माध्यम से 500 एमएल दिन पहले.
   नोट: स्पेक्ट्रोफोटोमीटर पर मापने इतनी है कि आप एक सटीक परिणाम प्राप्त करने से पहले अपने नमूना पतला.
4. परिवर्तन के दिन ठंडा बाँझ पानी और हाथ में एक sorbitol एम है. 5 मिनट के लिए 4 1500 XG में कोशिकाओं अपकेंद्रित्र डिग्री सेल्सियस ठंडा, बाँझ पानी के 500 एमएल के साथ गोली Resuspend.
5. 4 कदम के रूप में कोशिकाओं को फिर से अपकेंद्रित्र. ठंडा, बाँझ पानी के 250 एमएल के साथ गोली Resuspend.
6. चरण 4 में के रूप में कोशिकाओं को फिर से अपकेंद्रित्र. बहुत ठंडा 1 sorbitol एम के 20 एमएल में गोली Resuspend.
7. चरण 4 में के रूप में कोशिकाओं को फिर से अपकेंद्रित्र. ठंडा 1 ~ 1.5 एमएल की अंतिम मात्रा sorbitol एम 1 की एमएल में गोली Resuspend. बर्फ पर 4 डिग्री सेल्सियस तक आगे उपयोग के स्टोर या कोशिकाओं.
   नोट: हम और अधिक electrocompetent कोशिकाओं की तुलना में जरूरत तैयार और microcentrifuge ट्यूबों में 80 μl की aliquots में उन्हें -80 पर दुकान डिग्री सेल्सियस हम के लिए एक महीने से अधिक लंबी नहीं संग्रहित कोशिकाओं का उपयोग करें.

भाग 2: linearization और pPICZαA निर्माण की एकाग्रता

परिवर्तन के लिए प्रतिबंध पचाने में अपने हित के जीन युक्त वेक्टर linearize. हम एंजाइम PmeI का उपयोग करें. अन्य प्रतिबंध साइटों संभव हो रहे हैं. आप सुनिश्चित करें कि आपके डालने प्रतिबंध साइट आप उपयोग करना चाहते करने के लिए अपने वेक्टर linearize शामिल नहीं करता है. पी. में परिवर्तन के लिए pastoris आप 5-10 μl बाँझ पानी में linearized डीएनए के 5-20 μg की आवश्यकता होगी.

इसके अलावा linearize, ध्यान केंद्रित करने और पी. में सादे सदिश (नहीं डालने) हस्तांतरण pastoris. डालने के बिना माता पिता वेक्टर पृष्ठभूमि intracellular अभिव्यक्ति के लिए एक नियंत्रण है और आप अपने अभिव्यक्ति के परिणामों की व्याख्या करने के लिए अनुमति देता है.

1. बर्फ पर सभी अभिकर्मकों पहले गला लें, निम्नलिखित अभिकर्मकों गठबंधन और संक्षिप्त ट्यूब नीचे सभी तरल अपकेंद्रित्र, ट्यूब नल और फिर स्पिन:
   • एक्स μl बाँझ पानी
   • 5.0 μl 10X NEBuffer 4
   • 0.5 μl 100X BSA
   • 2 μg सदिश डीएनए (~ 100 एनजी / μl)
   • 2.0 μl PME मैं एंजाइम मिश्रण
   → 50 μl कुल प्रतिक्रिया मात्रा
   नोट: ऊपर मिश्रण अलग नलियों में 3 या 4 बार तैयार है और जब Amicon अल्ट्रा केन्द्रापसारक डिवाइस के माध्यम से पचा डीएनए ध्यान केंद्रित समाधान गठबंधन करने के लिए पर्याप्त linearized सदिश डीएनए प्राप्त.
2. 37 में सेते डिग्री सेल्सियस के लिए 3 घंटे और 20 मिनट के लिए गर्मी 65 डिग्री सेल्सियस पर एंजाइम मिश्रण निष्क्रिय.
3. मिल्ली क्यू पानी के 1 एमएल के साथ मतलब समय में एक Amicon अल्ट्रा-4 केन्द्रापसारक फ़िल्टर डिवाइस पूर्व कुल्ला, 4000 XG में 6-8 मिनट के लिए ट्यूब स्पिन और प्रवाह त्यागने के माध्यम से.
   नोट: अनुमति झिल्ली के बाहर एक बार गीली सूखी नहीं. यदि आप डिवाइस का उपयोग नहीं कर के बाद पूर्व rinsing, झिल्ली पर पानी छोड़ जब तक डिवाइस का प्रयोग किया जाता है.
4. चरण 2 से पूर्व rinsed Amicon केन्द्रापसारक फ़िल्टर यूनिट के लिए निष्क्रिय गर्मी समाधान स्थानांतरण, 4000 XG पर 6-8 मिनट के लिए ट्यूब और स्पिन के माध्यम से प्रवाह त्यागें.
   नोट: यदि आप एक से अधिक linearization मिश्रण तैयार किया है, एक Amicon केन्द्रापसारक फ़िल्टर यूनिट में सभी समाधान गठबंधन.
5. अपकेंद्रित्र जब तक Amicon फिल्टर समाधान की राशि लगभग 100 से कम है ~ 150 और मीटरयू, एल खाली ट्यूब के ऊपर से बाँझ पानी की एक 1.5 एमएल और जोड़ें Amicon ट्यूब के समाधान के हस्तांतरण और centrifugation कदम दोहराएँ. बाँझ पानी की 1.5 एमएल के साथ एक दूसरी बार धो और प्रवाह के माध्यम से फिर से त्यागें. ~~ 150 μl अंतिम मात्रा कम करें. धोने कदम arching रोकने जब कोशिकाओं स्पंदन बफर से शेष नमक निकालने.
   नोट: हम centrifugation कदम के लिए एक झूलते बाल्टी रोटर का उपयोग, बस एक 50 एमएल फाल्कन ट्यूब में छाया Amicon केन्द्रापसारक फिल्टर यूनिट जगह centrifugation के दौरान जगह में इसे पकड़. Amicon फिल्टर उपकरणों विस्तारित centrifugation के बाद भी फिल्टर पर समाधान के 50 μl बरकरार रहती है.
6. Amicon फ़िल्टर डिवाइस से डीएनए की तैयारी के आगे एकाग्रता के लिए एक पूर्व rinsed Microcon YM-30 केन्द्रापसारक फ़िल्टर यूनिट शेष डीएनए समाधान और हस्तांतरण बाँझ पानी की एक अतिरिक्त 50 μl सभी डीएनए की वसूली के साथ Amicon ट्यूब कुल्ला. 10,000 XG पर एक microcentrifuge में Microcon केन्द्रापसारक फ़िल्टर यूनिट अपकेंद्रित्र जब तक फ़िल्टर अभी भी थोड़ा है तरल के साथ कवर किया. केवल एक कम समय के लिए स्पिन और हर मिनट की जाँच करें अगर केवल तरल पदार्थ की एक छोटी राशि फिल्टर पर छोड़ दिया है. अपने डीएनए समाधान ठीक करने के लिए, एक नया microcentrifuge और 3 मिनट के लिए 1000 XG पर एक दूसरे centrifugation कदम में ट्यूब स्पिन में फिल्टर उल्टा जगह. अंतिम मात्रा में कुल 10-15 μl अधिक नहीं होनी चाहिए, अन्यथा आपके डीएनए भी परिवर्तन कदम के लिए पतला किया जा सकता है.
   नोट: फ़िल्टर डिवाइस भी लंबे समय स्पिन नहीं करते हैं और यह शुष्क करने की क्षमता नमूना नुकसान को रोकने के पूरी तरह से नहीं. यदि आपके झिल्ली सूखी है, झिल्ली पर 10-15 μl बाँझ पानी जोड़ने के लिए, 30 सेकंड के लिए धीरे आंदोलन और ऊपर वर्णित के रूप में अपने डीएनए की वसूली.

भाग 3: पी. में परिवर्तन electroporation द्वारा pastoris

1. linearized और केंद्रित pPICZαA अपने डालने वाले डीएनए अब electrocompetent पी. में परिवर्तन के लिए तैयार pastoris कोशिकाओं (मैं कदम, भाग 2 देखें). परिवर्तन से पहले 15 मिनट के बारे में निम्नलिखित अभिकर्मकों और उपकरणों तैयार हैं: 1 sorbitol एम के 1 एमएल के साथ एक microcentrifuge ट्यूब भरने और यह बर्फ पर जगह जगह बर्फ पर एक 0.2 सेमी electroporation क्युवेट, एक बाँझ 15 एमएल ग्लास ट्यूब लेबल और एक बाँझ है हाथ में गिलास पाश्चर विंदुक.
2. मैं कदम, 2.7 भाग से कोशिकाओं के 80 μl एक ठंडा 0.2 सेमी electroporation क्युवेट के लिए स्थानांतरण. पक्ष की ओर से electroporation क्युवेट में पिपेट टिप हिल द्वारा ध्यान केंद्रित linearized pPICZαA डीएनए समाधान मैं कदम, 3.6 हिस्सा है और मिश्रण से जोड़ें.
   नोट: जब डीएनए जोड़ने केवल पहले रोकने के लिए विंदुक धक्का. साथ डीएनए के मिश्रण के बाद कोशिकाओं दूसरे को रोकने के लिए विंदुक धक्का और धीरे क्युवेट से हटायें.
3. 5 मिनट के लिए बर्फ पर कोशिकाओं के साथ क्युवेट सेते हैं.
4. एक ऊतक के साथ क्युवेट के बाहर पोछो और खमीर (Saccharomyces cerevisiae) के रूप में विशिष्ट electroporation इस्तेमाल किया जा रहा है डिवाइस के निर्माता द्वारा सुझाए के लिए मापदंडों के अनुसार कोशिकाओं नाड़ी.
   नोट: हम निम्नलिखित शर्तों के साथ एक जैव रेड GenePulser का उपयोग करें:
   • (वी) वोल्टेज चार्ज: 1500;
   • समाई (μF): 25;
   • (Ω) प्रतिरोध: 200.
   एक 0.2 सेमी electroporation क्युवेट का प्रयोग, प्रोटोकॉल ~ 10 एमएस की एक नाड़ी की लंबाई ~ 7500 वी / सेमी का एक क्षेत्र ताकत के साथ उत्पन्न करता है.
5. तुरंत ठंडा 1 क्युवेट के लिए sorbitol एम के 1 एमएल जोड़ें. एक बाँझ 15 एमएल बाँझ कांच पाश्चर पिपेट का उपयोग ट्यूब क्युवेट सामग्री स्थानांतरण.
6. 30 ° C पर 1.5 घंटे के लिए मिलाते हुए बिना ट्यूब सेते चलो.
7. चार लेबल YPDS 100 μg / एमएल Zeocin युक्त प्लेटों पर 5-7 निष्फल ग्लास मनकों जोड़ें. 15 एमएल ग्लास ट्यूब से electroporation मिश्रण के प्रत्येक प्लेट पर 250 μl बिखरा हुआ है. हिलाएँ थाली क्षैतिज समान रूप से बाहर करने के लिए कोशिकाओं में फैल. चलो प्लेट 15 मिनट के लिए सूखी और फिर अगर से inverting थाली से मोती निकाल.
   नोट: हम 100 μg / एमएल Zeocin का उपयोग करें का चयन करने के transformants के लिए जब GS115 Pichia तनाव का उपयोग. चयन शर्तों भिन्न हो सकते हैं अगर आप किसी अन्य Pichia तनाव का उपयोग कर रहे हैं.
8. प्लेटें उल्टा कालोनियों फार्म 30 पर 2 से 3 दिनों ° सी के लिए जब तक सेते हैं. प्रकाश के प्रति संवेदनशील Zeocin की गिरावट को रोकने के लिए एक काले रंग की प्लास्टिक प्लेटों लपेटें. प्लेटों में एंटीबायोटिक की कम राशि झूठी सकारात्मक क्लोनों में परिणाम कर सकते हैं.
9. बाद कालोनियों का गठन किया है, 12 कालोनियों लेने और उन्हें ताजा YPDS 100 μg / Zeocin के एमएल युक्त प्लेटों पर क्लोन streaking करके शुद्ध.

द्वितीय चरण: Pichia pastoris में प्रोटीन अभिव्यक्ति

इस कदम के लिए आप हाथ में निम्नलिखित मीडिया प्लेटें, और अभिकर्मकों की आवश्यकता होगी:

• BMGY मध्यम
• ग्लिसरॉल निष्फल,
• BMMY मध्यम
• मेथनॉल, निष्फल
• EPICENTRE खमीर डीएनए शुद्धि किट

आपनिम्नलिखित बोतल की जरूरत है:

• 250 एमएल फ्लास्क autoclaved,
• 1 एल चकित फ्लास्क, autoclaved
• 200 एमएल बीकर, autoclaved

भाग 1: Pichia pastoris में प्रोटीन अभिव्यक्ति

निम्न चरणों का पालन भी बदल नियंत्रण सदिश (कोई डालने के साथ) के लिए प्रदर्शन कर रहे हैं.

1. मैं कदम, 3.9 भाग से शुद्ध Pichia कालोनियों से एक ही कॉलोनी उठाओ और एक बाँझ 250 एमएल फ्लास्क में 25 एमएल BMGY में टीका लगाना. 30 ° सी मिलाते संस्कृति जब तक इनक्यूबेटर (250-300 rpm) में एक आयुध डिपो ₆₀₀ तक पहुँचता = 2-6 (लगभग 16-18 घंटे). बढ़ता
   नोट: स्पेक्ट्रोफोटोमीटर पर मापने इतनी है कि आप एक सटीक परिणाम प्राप्त करने से पहले अपने नमूना पतला. कोशिकाओं लॉग चरण के विकास में किया जाएगा.
2. जब कोशिकाओं को उचित आयुध डिपो ₆₀₀ तक पहुँच चुके हैं एक ग्लिसरॉल स्टॉक तैयार है . एक 2 एमएल Corning cyrogenic शीशी 25 एमएल सेल संस्कृति के 800 μl स्थानांतरण और निष्फल ग्लिसरॉल के 200 μl जोड़ें. -80 में ग्लिसरॉल शेयर और स्टोर रुक डिग्री सेल्सियस
3. खमीर डीएनए शुद्धीकरण के लिए, एक microcentrifuge ट्यूब के लिए 25 एमएल सेल संस्कृति की 1.5 एमएल हस्तांतरण. कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए 1300 XG centrifuging कोशिकाओं हार्वेस्ट. इन कोशिकाओं को Pichia integrants का विश्लेषण करने के लिए डबल चेक अगर ब्याज की जीन Pichia जीनोम (कदम द्वितीय, part2) में एकीकृत किया गया है के लिए उपयोग किया जाता है . 4 में कक्ष गोली का स्टोर डिग्री सेल्सियस तक आगे के विश्लेषण के.
4. एक 50 एमएल फाल्कन ट्यूब बाकी 25 एमएल संस्कृति के स्थानांतरण और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 3000 XG centrifuging कोशिकाओं फसल. छानना सतह पर तैरनेवाला और एक ऊतक पर उल्टा नीचे जगह ट्यूबों के लिए किसी भी अवशिष्ट मीडिया को दूर. सेल धो गोली 20 एमएल BMMY में resuspend के लिए किसी भी शेष BMGY माध्यम निकालने के लिए, BMGY माध्यम से ग्लिसरॉल के रूप में बाद में अभिव्यक्ति को बाधित कर सकते हैं. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 3000 XG पर फिर से अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला छानना.
5. 1.0 BMMY मध्यम में Resuspend सेल की गोली से _एक 600 आयुध डिपो के लिए अभिव्यक्ति उत्पन्न करने के लिए (लगभग 100-200 एमएल) और 1 लीटर चकित फ्लास्क में संस्कृति हस्तांतरण . एक 200 एमएल बीकर के साथ फ्लास्क कवर और इनक्यूबेटर करने के लिए वापस जाने के लिए 30 में वृद्धि जारी रखने डिग्री सेल्सियस
   नोट: यह महत्वपूर्ण है कि तापमान 30 से अधिक नहीं करता है डिग्री सेल्सियस यदि अपने इनक्यूबेटर fluctuates के तापमान 28, तापमान सेट डिग्री सेल्सियस पर्याप्त वातन भी मेथनॉल अधिष्ठापन के दौरान कुशल अभिव्यक्ति के लिए एक महत्वपूर्ण प्राचल (जब अभिव्यक्ति उत्प्रेरण से अधिक है, एक संस्कृति> की मात्रा कभी अपने कुल फ्लास्क मात्रा के 10-30%) है. हम अत्यधिक चकित बोतल के इस्तेमाल की सिफारिश के रूप में वे संस्कृति मीडिया में और अधिक ऑक्सीजन परिचय.
6. 0.5% मेथनॉल के अंतिम एकाग्रता के लिए हर 24 घंटे निष्फल शुद्ध मेथनॉल जोड़ें प्रेरण बनाए रखने.
7. अभिव्यक्ति हस्तांतरण एक संस्कृति का एक 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब एमएल की शुरुआत के बाद कुछ समय बिंदुओं पर. कमरे के तापमान में 2.5 मिनट के लिए 1300 XG अपकेंद्रित्र. सतह पर तैरनेवाला एक अलग 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब स्थानांतरण. आगे के विश्लेषण तक स्टोर -80 में सतह पर तैरनेवाला और सेल छर्रों ° सी. अधिष्ठापन के बाद प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए इष्टतम समय अवधि की स्थापना अलग समय बिंदुओं से नमूने विश्लेषण किया जाएगा.
   नोट: हम 6, 12h, 24 घंटों, 36h और नमूने लेने के लिए समय अंक के रूप में 48h चुनते हैं. 4 दिनों के लिए आगे विकास संभव है. इष्टतम समय अंक अलग व्यक्त प्रोटीन के बीच बदलती हैं.
8. Coomassie से सना हुआ एसडीएस PAGE और पश्चिमी दाग ​​(इस प्रोटोकॉल में वर्णित नहीं) द्वारा supernatants और प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए सेल छर्रों का विश्लेषण.

भाग 2: खमीर डीएनए शुद्धीकरण और Pichia अविभाज्य का पीसीआर विश्लेषण

BMGY में Pichia संस्कृति का खमीर डीएनए शुद्धि कदम के लिए सभी आवश्यक अभिकर्मकों MasterPure EPICENTRE से खमीर डीएनए शुद्धीकरण किट में शामिल हैं.
नोट: इस विश्लेषण के लिए अतिरिक्त है और अगर ब्याज की जीन Pichia जीनोम में एकीकृत किया गया है निर्धारित करने के लिए किया है. सेल गोली एक 1.5 एमएल BMGY में संस्कृति (कदम द्वितीय, 1.3 हिस्सा देखें) से लिया नमूना से प्रयोग किया जाता है.

Epicentre MasterPure खमीर डीएनए शुद्धीकरण पुस्तिका के निर्देशों का पालन करें और चलाने डालने के लिए विशिष्ट प्राइमरों के साथ खमीर डीएनए के साथ एक पीसीआर. अपने एक agarose जेल युक्त 1 μl ethidium ब्रोमाइड पर पीसीआर उत्पाद के 3 μl विश्लेषण. एक अच्छी तरह से एक 1 Kb ⁺ आकार मार्कर शामिल करने के लिए अपने डालने के आकार की व्याख्या और एक जेल प्रलेखन स्टेशन का उपयोग डीएनए कल्पना.

पुनः संयोजक प्रोटीन पश्चिमी धब्बा विश्लेषण द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है. प्रोटीन शुद्धि धातु प्रभारित राल (इस प्रोटोकॉल में वर्णित नहीं) पर उसकी टैग शुद्धि के द्वारा प्रदर्शन किया जा सकता है.

परिशिष्ट, व्यंजनों की सूची

मैं कदम:

1. YPD मध्यम:
   600 एमएल तैयार करने के लिएYPD मध्यम (खमीर निकालें Peptone Dextrose मध्यम) पानी की 540 मिलीलीटर में 5 छ खमीर निकालने और 12 ग्राम peptone भंग. तरल चक्र पर 20 मिनट के लिए आटोक्लेव.
   मतलब समय में 20% डेक्सट्रोज और उपयोग करने से पहले फिल्टर बाँझ के 70 एमएल तैयार करते हैं.
   60 ~ autoclaved समाधान शांत करते ° सी और फिल्टर निष्फल 20% डेक्सट्रोज के 60 एमएल जोड़ने.
2. YPDS प्लेटें (Zeocin +):
   YPDS के 500 एमएल + Zeocin अगर (खमीर निकालें Peptone Sorbitol साथ Dextrose मध्यम) 5 छ खमीर निकालने, 91.1 ग्राम sorbitol और 10 पानी की 450 मिलीलीटर में जी peptone भंग तैयार. अगर के 10 ग्राम और एक चुंबकीय हलचल और तरल चक्र पर 20 मिनट के लिए बार आटोक्लेव जोड़ें.
   मतलब समय में 20% डेक्सट्रोज और उपयोग करने से पहले फिल्टर बाँझ के 60 एमएल तैयार करते हैं.
   60 ~ autoclaved समाधान शांत करते ° सी, फिल्टर निष्फल 20% डेक्सट्रोज के 50 एमएल जोड़ें.
   Zeocin बिना YPDS प्लेटों के लिए एंटीबायोटिक जोड़ने से पहले कुछ प्लेटें डालो. फिर एक 100 मिलीग्राम / एमएल शेयर समाधान से 500 μl Zeocin जोड़ने के लिए अगर में 100 Zeocin / μg मिलीलीटर की एक अंतिम एकाग्रता प्राप्त. चलो एक चुंबकीय थाली पर हलचल जब एंटीबायोटिक जोड़ने और एक अतिरिक्त 2 मिनट के लिए समान रूप से मिश्रण के बारे में जाने के लिए हलचल.
   पेट्री डिश में मीडिया डालो और काले प्लास्टिक के साथ कवर. प्लेटें बेंच पर रात भर सूखी चलो. 4 में स्टोर YPD Zeocin युक्त प्लेटें डिग्री सेल्सियस शैल्फ जीवन में एक से दो सप्ताह है.
   नोट: प्लास्टिक के साथ कवरेज के लिए आवश्यक है क्योंकि Zeocin प्रकाश के प्रति संवेदनशील है.

द्वितीय चरण:

1. BMGY (buffered मध्यम ग्लिसरॉल के जटिल) और BMMY (मेथनॉल जटिल मध्यम buffered):
   खमीर निकालने और 560 एमएल पानी में 16 ग्राम peptone के प्रत्येक मध्यम जी 8 के लिए भंग. तरल चक्र पर 20 मिनट के लिए आटोक्लेव.
   मतलब समय में निम्न समाधानों को तैयार:
   • 1 एम पोटेशियम फॉस्फेट बफर, पीएच 6.0:
   1M कश्मीर _{2 4} HPO और 1M कश्मीर ₂ HPO के ₄ 156 एमएल के 24 एमएल का मिश्रण है और पुष्टि है कि पीएच 6.0 = (यदि पीएच को समायोजित करने की जरूरत है, फॉस्फोरिक एसिड या KOH का उपयोग करें). बाँझ फ़िल्टर और कमरे के तापमान पर दुकान. इस समाधान के शैल्फ जीवन एक वर्ष से अधिक है.
   • 10X YNB (13.4% में अमीनो एसिड के बिना अमोनियम सल्फेट साथ खमीर नाइट्रोजन बेस ):
   अमोनियम सल्फेट और पानी और बाँझ फिल्टर के 200 एमएल में अमीनो एसिड के बिना खमीर नाइट्रोजन बेस के 26.8 ग्राम (YNB) भंग. YNB पानी में पूरी तरह से भंग करने के लिए समाधान हीट. 4 में स्टोर डिग्री सेल्सियस इस समाधान के शैल्फ जीवन लगभग एक वर्ष है. नोट: वैकल्पिक रूप से, अमोनियम सल्फेट और एमिनो एसिड के बिना बिना YNB के 3.4 ग्राम का उपयोग करें और अमोनियम सल्फेट के 10 ग्राम जोड़ें.
   • 500X बी (0.02% बायोटिन):
   पानी फिल्टर और बाँझ की 50 एमएल में 10 मिलीग्राम बायोटिन भंग. 4 में स्टोर डिग्री सेल्सियस इस समाधान के शैल्फ जीवन लगभग एक वर्ष है.
   • 10X एम (5% मेथनॉल):
   पानी के 95 एमएल के साथ मेथनॉल के 5 एमएल मिक्स. बाँझ फ़िल्टर और 4 बजे दुकान डिग्री सेल्सियस इस समाधान के शैल्फ जीवन लगभग दो महीने है.
   • 10X GY (10% ग्लिसरॉल):
   पानी के 90 एमएल के साथ ग्लिसरॉल के 10 एमएल मिक्स. बाँझ फ़िल्टर. कमरे के तापमान पर स्टोर. इस समाधान के शैल्फ जीवन एक वर्ष से अधिक है.
   चलो autoclaved कमरे के तापमान शांत करने के लिए समाधान है, तो निम्नलिखित जोड़ने और मिश्रण अच्छी तरह से:
   • 80 एमएल 1 एम पोटेशियम फॉस्फेट बफर, पीएच 6.0;
   • 80 एमएल 10X YNB
   • 0.16 एमएल 500X बी
   • 80 एमएल 10X GY
   BMMY की तैयारी के लिए, 80 एमएल 10X के बजाय एम ग्लिसरॉल जोड़ें.
   4 में स्टोर मीडिया डिग्री सेल्सियस इस समाधान के शैल्फ जीवन लगभग दो महीने है.

प्रतिनिधि परिणाम

चित्रा 1. यह पश्चिमी धब्बा छवि अभिव्यक्ति के 24 घंटे के के बाद चार व्यक्त प्रोटीन (1605, 0537, 1228, और 1682 के रूप में चिह्नित) से पता चलता है. immunoblotting के लिए इस्तेमाल किया एंटीबॉडी एंटीबॉडी ग myc-एचआरपी था. दूसरी लेन (एन लेबल) एक नकारात्मक नियंत्रण है और कोशिकाओं से सतह पर तैरनेवाला कि एक पुनः संयोजक प्रोटीन व्यक्त नहीं करते के साथ लोड किया गया था क्योंकि वे माता पिता (सादे) सदिश के साथ बदल रहे थे.

Discussion

प्रोटीन एक मेजबान सिस्टम के रूप में अभिव्यक्ति का उपयोग methylotrophic खमीर Pichia pastoris इस प्रोटोकॉल में वर्णित है. प्रोटीन प्रयुक्त क्लोनिंग सदिश के आधार पर मध्यम में secreted किया जा सकता है है. पुनः संयोजक प्रोटीन के स्राव के बाद शुद्धि आसान बनाता है. हालांकि, दिखाया शर्तों करने के लिए अलग अलग प्रोटीन और शर्तों में परिवर्तन और अभिव्यक्ति बार की अभिव्यक्ति के लिए अनुकूलित वृद्धि की प्रोटीन के स्तर में परिणाम कर सकते हैं हो सकता है. इस प्रोटोकॉल में प्रयुक्त सदिश एक ग myc मिलान और एक एंटीबॉडी के लिए इस मिलान को खरीदा जा सकता है की सुविधा है . यह प्रोटीन का विश्लेषण की अनुमति देता है जिसके लिए वहाँ कोई एंटीबॉडी अभी तक उपलब्ध हैं. पैरेंट वेक्टर की उनकी टैग की सुविधा धातु chelating राल पर प्रोटीन शुद्धि की सुविधा है और वहाँ भी उपलब्ध वेक्टर की उनकी टैग अनुभाग के लिए एक एंटीबॉडी है.

Pichia pastoris में प्रोटीन अभिव्यक्ति के रूप में इस प्रोटोकॉल में वर्णित एक multistep प्रक्रिया की जरूरत है जो करने के लिए और अच्छी तरह से योजना बनाई जा तैयार है. एक समय दो से तीन सप्ताह के सभी चरणों का पालन करने की आवश्यकता है, लेकिन ब्याज की जीन के साथ का निर्माण की क्लोनिंग को छोड़कर. पी. में सफल परिवर्तन के लिए आधार pastoris उच्च परिवर्तन कुशल सक्षम खमीर कोशिकाओं और एक linearized का निर्माण है जो खमीर जीनोम में एकीकृत कर सकते हैं. पश्चिमी धब्बा विश्लेषण और उनकी-टैग शुद्धि करने के लिए पुनः संयोजक प्रोटीन अभिव्यक्ति के स्तर का निर्धारण करने के लिए आवेदन कर रहे हैं और अगले कदम के लिए इस प्रोटोकॉल के बाद प्रदर्शन कर रहे हैं.