Summary
Wir beschreiben ein Verfahren zur Analyse der Veränderung der N-Glycane durch das frühe Leben von Glykoproteinen nach ihrer Biosynthese in Säugetierzellen. Dies wird durch Puls-Chase Analyse der metabolisch markierten Glykane, enzymatische Freisetzung von Glykoproteinen und Prüfung durch HPLC erreicht.
Abstract
Die Befestigung der Glc
Protocol
Das folgende Protokoll ist für die Analyse der Zuckerketten von insgesamt Glykoproteine oder eines bestimmten Glykoproteins von Interesse bestimmt. Das Verfahren ist grundsätzlich das gleiche für die beiden Fälle mit ein paar Änderungen, wie in dem Protokoll angegeben.
- Für metabolische Markierung von N-verknüpften Glykane, muss man eine subkonfluenten Kultur von Säugerzellen über Nacht in einer 90 mm-Schale für jede Probe gewachsen verwenden (Proben repräsentieren verschiedene Zeitpunkte oder Behandlungen). Dieses Protokoll wird für NIH 3T3-Zellen optimiert.
- Hungern der Zellen für Glukose durch Inkubation in 5 ml frisch zubereiteter vorgewärmten (37 ° C) Glucose-freiem Medium mit 10% dialysiert FCS und 4 mM Natriumpyruvat für 5-15 Minuten geliefert.
- Ersetzen Sie den Hungertod Medium mit 1 ml vorgewärmten (37 ° C) Glucose-freiem Medium mit 400 uCi [2 bis 3 H]-markierte Mannose (niedrigere Konzentration von 65 Ci / ml ist für die Kennzeichnung von insgesamt Glykoproteine verwendet werden), und inkubieren Sie die Zellen in den normalen Gewebekulturen Bedingungen für 1 Stunde.
- Entfernen Sie die Markierung Medium von jeder Probe, und vorsichtig 2 ml PBS bei 4 ° C, um die Proben entsprechend Puls und legen sie auf Eis (dieser Proben werden als Impulse bezeichnet), während die Proben entsprechend der Jagd zu sein brauchen gespült 3 mal mit 2 ml vorgewärmten (37 ° C) normal komplettem Kulturmedium, und dann in einer CO 2-Inkubator bei 37 ° C mit 5 ml vorgewärmten regelmäßigen Medium für die gewünschte Chase Perioden.
- Spülen Sie den Puls Proben (vorher auf Eis gelegt) 3 mal mit 2 ml eiskaltem PBS. Die Zellen werden dann von der Schüssel in 2 ml PBS mit einem Zellschaber abgekratzt, und in ein 2 ml Eppendorf-Röhrchen.
- Short-spin die Zellen bei 16000Xg (6-10 sec), den Überstand verwerfen und frieren das Zellpellet bei -80 ° C.
- Führen Sie die Schritte 5 und 6 auch für die Jagd Proben am Ende der Verfolgungsjagd Zeit.
- Entfernen Sie die Zellen aus dem Gefrierschrank und lysieren sie durch Zugabe von 300 ul Puffer A, Vortexen kurz und Inkubation für 20 min auf Eis oder im Falle von insgesamt Glykoproteine Analyse durch Inkubation 20 min auf Eis mit Puffer B, mit anschließender Ultraschallbehandlung (4-mal, 10 sec, maximale Amplitude), dann kochen die Proben für 5min.
- Zentrifugieren Sie die Lysate bei 16000Xg für 20 min bei 4 ° C. Übertragen Sie den Überstand in ein neues Eppendorf Tube und entsorgen Sie die Pellets.
- Wenn die Analyse insgesamt Glykoproteine, die molekulare Filtration und Deglykosylierung (Schritt 17) fort. Für Immunpräzipitation der H2a Glykoprotein hier demonstriert, fügen 20l/sample von (Repligen) Protein A-Agarose-Beads 1:1 Aufhängung und 3 pl / Probe unserer polyklonalen Kaninchen-anti H2a Antikörper für die gewünschte Glycoprotein (in unserem Beispiel anti-H2a Antikörper ), der Überstand aus Schritt 9 fort.
- Inkubieren Sie die Proben für 4-16 Stunden bei 4 ° C, dauernd Mischen durch langsame Rotation.
- Spin down die Perlen an 16000Xg für 30 Sekunden, und entfernen Sie vorsichtig den Überstand mittels Vakuum.
- Spülen Sie die Perlen, durch Zugabe von 500 ul Puffer D und Vortexen. Spin wie in Schritt 12 und entfernen Sie den Überstand. Wiederholen Sie die 3 x waschen.
- Add 10 &mgr; l Denaturierungspuffer (im Lieferumfang der NEB endo-H-Kit), um den Wulst Pellet und kochen die Proben für 5 min (bei insgesamt Proteine analysiert werden, die Deglykosylierung befindet sich auf der Microcon Filter, Schritt 17 durchgeführt).
- Spin down die Perlen (16000Xg für 30 Sekunden) und den Überstand in ein neues Eppendorf-Röhrchen. Dann 0.5μl von Endo H-Enzym sind zu jeder Probe zusammen mit 10 ul des Reaktionspuffer (auch mit der NEB Endo H-Kit im Lieferumfang enthalten) hinzugefügt und die Proben werden bei 37 ° C für 3 Stunden.
- Zur Trennung der freigesetzten Glykane von den Proteinen, wird die Probe 5 mal mit deionisiertem Wasser verdünnt und auf der Spitze eines molekularen Filter (Microcon Ultracel YM30), mit einem 30-kDa cut-off, dann 14000Xg für 3 min zentrifugiert. Übernehmen 50 ul entionisiertem Wasser und wiederholen Zentrifugation der Proben. Das Auswaschen wird 2 weitere Male wiederholt, halten die Durchströmung.
- Wenn Sie die Analyse insgesamt Glykoproteine sind, gelten dem Überstand der Lysate (aus Schritt 9), die Microcon Filter. Der Extrakt wird mit 100 ul Puffer E, 3-mal durch wiederholte Zentrifugation bei 14000Xg für 3 min. Add 3 ul 10x Endo H Reaktionspuffer und 1,5 ul des Endo H-Enzym, die Microcon Retentat, und Inkubation für 3 Stunden bei 37 ° C. Die freigesetzten Glykane sind mit entionisiertem Wasser durch 3 wiederholt Zentrifugationen eluiert, wie in Schritt 16.
- Falls gewünscht, werden Retentate aus den Schritten 16 und 17, mit Endo H-resistente Glykoproteine dann mit 200mU von N-Glycosidase F in 15 ul Puffer C inkubiert, bei 37 ° C für 16 h Elution mit deionisiertem Wasser wird wie in Schritt 16 durchgeführt.
- Das Röhrchen mit dem Endo H Reaktion Flow-Through-(Stufen 16 und 17) in einem SpeedVac KonzentratorUnd trocknen die Proben vollständig (dies kann bis zu 45 erfolgen ° C, um diesen Prozess zu beschleunigen).
- Zur Vorbereitung der Proben für die HPLC, resuspendieren die trockenen Pellets in 12 ul der HPLC Lösungsmittel (Acetonitril: Wasser, 60:40, 1% Phosphorsäure).
- Passen Sie die HPLC-Gerät (verbunden mit dem Spherisorb Spalte) zu konstanten Fluss des Lösungsmittels (1 ml / min) und Druck (ein bestimmter Wert zwischen 1000 und 2000 psi), und setzen Sie ein Fraktionssammler Änderungen ein Rohr alle 1 Minute.
- Laden Sie die Proben in die HPLC-Gerät und starten Sie den Fraktionssammler gleichzeitig.
- Sammeln Sie 48 Fraktionen von 1 ml von jeder Probe laufen und ab einer Auflage von einer Standard-Oligosaccharid-Gemisch.
- Transfer 500 ul von jeder Fraktion ein Scintillationsfläschchen, und mischen Sie den Inhalt mit 3 ml Wasser mischbar Szintillationsflüssigkeit.
- Laden Sie das Fläschchen und lesen in einem Szintillationszähler.
- Die cpm-Anzeige wird als Funktion der Fraktion Zahl aufgetragen.
- Die cpm-Werte innerhalb einer Spitzenleistung stellen eine besondere Glycanspezies wie folgt: Fraktionen 18-21 bis M5, Fraktionen 22-26 bis M6, Fraktionen 27-31 bis M7, Fraktionen 32-35 entsprechen M8, Fraktionen 36-39 bis M9, Fraktionen 40-42 zu G1M9 und Fraktionen 43-45 zu G2M9.
- Die Summe der cpm-Werte für die Fraktionen innerhalb der einzelnen Gipfel spiegelt die absolute Menge eines bestimmten Glycanspezies. Die absolute Höhe der einzelnen Glycanspezies wird durch die Anzahl der Mannoseresten, die es enthält unterteilt: Um sich für die Tatsache, dass Spezies mit mehr Mannoseresten mehr label, die "relative molare Menge" von jedem Glycanspezies berechnet sich wie folgt erwerben zu kompensieren . Dieser Wert wird dann durch die Summe der relativen molaren Mengen aller Glycanspezies erhalten, um die "Prozent aller" für jede spezifische Glycanspezies dividiert.
| Chase (h) | 0 | 4 |
| Freigegeben mit Endo H (cpm) eine | 90000 | 16800 |
| Freigegeben mit N-Glycosidase F (cpm) b | 20400 | 3900 |
| Glykoproteine in Retentat (cpm) c | 371700 | 127695 |
| Dolichol-Oligosaccharide in Retentat (cpm) d | 4350 | 540 |
| Dolichol-Oligosaccharide in Retentat (%) e | 1,4 ± 0,7 | 0,2 ± 0,2 |
Tabelle 1. Analyse der Freisetzung von N-verknüpften Zuckerketten mit deglycosidases und der Anwesenheit von Dolichol-Oligosaccharide in Glykoprotein Proben.
Wir wendeten die Pulse-Chase-Verfahren, um ein Lysat von NIH 3T3-Zellen. Nach Microcon Filtration, wurden als N-gebundene Oligosaccharide in erster Linie mit Endo H nach Puls Kennzeichnung (high Mannose-Typ) und bei weiterer Behandlung mit N-Glycosidase F nach einer Verfolgungsjagd aus, was zu komplexen Typs (Golgi-verarbeitet Glykane) entsprechen würde entlassen, Endo H resistent Oligosaccharide. Diese quantitative Analyse festgestellt, dass Dolichol-Oligosaccharide, entfielen einen unbedeutenden Bruchteil des Etiketts in der ersten Retentat.
Notes:
- NIH 3T3-Zellen wurden Puls mit [2 bis 3 H] Mannose und jagte mit Komplett-Medium. Nach Zelllyse und Filtration durch Microcon YM30 wurden hohe Mannose N-gebundene Oligosaccharide aus Retentate durch Inkubation mit Endo H. veröffentlicht
- Endo H-resistentem Material in Microcon Retentate aus (a) wurde dann mit N-Glycosidase F inkubiert und freigegeben Oligosaccharide in einem Szintillationszähler gemessen.
- : Methanol: Wasser 10.10.03 um Vorläufer Glykolipide entfernen, und die extrahierten Material in 1N NaOH gelöst und in einem Szintillationszähler Microcon Retentate wie in (a) vor dem Endo H-Behandlung wurden 4 mal mit Chloroform extrahiert wird.
- Dolichol-Oligosaccharide wurden aus Extrakten aus (c) wie in 1 beschrieben und in einem Szintillationszähler gereinigt.
- Durchschnitt von 3 Experimenten für Prozent Dolichol-Oligosaccharide (d) der gesamten cpm in Retentat (c + d).
Repräsentative Ergebnisse
Abbildung 1. Pulse-Chase Analyse der gesamten NIH 3T3 Glykoproteine in unbehandelten Zellen und auf proteasomalen Hemmung Nach 1h Puls-Markierung mit. [2 bis 3 H] erhielten wir eine erwartete Profil mit einigen glucosyliertenVorläufer restlichen (Glc 2 Man 9 GlcNAc 2 (G2M9) und G1M9), aber die meisten der Label in M9 und M8 Arten, wobei letztere das Ergebnis Trimmen aller Glucose und einem Mannoserest (Abbildung 1 A). Kein freier Mannose oder andere kleine Vorstufen festgestellt wurden, hervorgeht, dass die Gründlichkeit der Reinigung. Nach einer ziemlich langen 8h jagen gab es umfangreichere Trimmen M7-6 und eine kleine Menge von M5, aber die großen Arten weiter M9 und M8 (Abbildung 1 B). Wenn die Jagd in der Gegenwart eines proteasomalen Inhibitor (30 uM MG-132) durchgeführt wurde, gab es nur eine geringe Akkumulation dieser gleichen getrimmt Spezies (Abbildung 1 C).
Abbildung 2. Quantitative Analyse der Zuckerketten eines ERAD Substrat insgesamt Glykoproteine verglichen. (A) In einem Experiment, ähnlich dem in Abbildung 1 wurden relative molare Mengen von jedem Oligosaccharid Arten basierend auf Mannose-Gehalt berechnet. Wir konvertierten die cpm-Werte für jedes Glycanspezies erhalten, der prozentuale Anteil der einzelnen Arten bezogen auf die gesamte Summe der relativen molaren Mengen aller Arten, die damals als eine Funktion der Jagd Zeit für einen Durchschnitt von zwei Experimenten aufgetragen. (B) Ähnliche zu (A), außer dass Glykane vom ERAD Substrat ASGPR H2a veröffentlicht wurden analysiert nach dem Puls Kennzeichnung und Verfolgung von bis zu 4h, in der Gegenwart oder Abwesenheit des proteasomalen Inhibitor MG-132. (C)-Werte für 4h Jagd in der Gegenwart von MG-132 aus (A) und (B) sind für ASGPR H2a und das Glykoprotein Pool verglichen. (D) Schema von N-verknüpften Zucker-Kette Trimmen Prozesse in der ER. Zucker Trimmen Prozesse, die M6-5-Leitung in Verbindung mit Proteinen (R), dass eine gezielte, um ERAD sind im Vergleich zu M9-8 auf diejenigen, Ausgang zum Golgi und darüber hinaus. Die Ergebnisse zeigen, dass die ERAD-Prozess mit dem Mannose Trimmen von N-Glykane von Arten mit 5-6 Mannoseresten restliche Ausbeute verbunden ist.
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Discussion
Die Pulse-Chase Analyse der Glykane in lebende Zellen mit HPLC-Trennung bietet eine Methode zur Untersuchung der Dynamik von Oligosaccharid bauliche Veränderungen während der gesamten Lebensdauer eines Glykoproteins. Es gibt zunehmend Beweise, dass solche Änderungen bei der Erzeugung der Signale für ER falten, Qualitätskontrolle und-handel Systemen 2-5 sind beteiligt. Die Methode kann nicht nur für einen bestimmten Glykoprotein von Interesse, sondern auch für die Analyse der Dynamik der Struktur der gesamten Glykoproteine, wie in diesem Artikel dargestellt, wo wir im Vergleich der kontrastierenden Schicksal eines spezifischen ERAD Substrat und der zellulären Glycoprotein-Pool angewendet werden . Das Reinigungsverfahren ist einfach, aber dennoch spezifisch. Durch die Verwendung von strengen deglycosidases und Molekularfiltration ist sichergestellt, dass nur N-Glycane von Glycoproteinen freigesetzt erhalten werden, hinterlässt anderen Makromolekülen mit [2 bis 3 H] Man, wie O-linked Zuckerketten und GPI-verankerte Proteine. Oligosaccharide aus der Dolichol Vorstufe freigesetzt werden eine zu vernachlässigende Verunreinigung (Tabelle 1).
Das Verfahren bietet eine hohe Empfindlichkeit des Nachweises über eine sehr kleine Menge des Ausgangsmaterials. Wenn erwarte eine sehr geringe Ausbeute lässt sich die Empfindlichkeit weiter, indem das Volumen der HPLC-Fraktionen mit SpeedVac erhöht werden. So kann die Löslichkeit Begrenzung der Szintillationsflüssigkeit überwunden werden und der gesamte Inhalt der Fraktionen kann im Szintillationszähler überwacht werden.
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Acknowledgments
Wir danken Zehavit Frenkel und Sandra Tolchinsky für technische Unterstützung. Forschung im Zusammenhang mit dieser Arbeit wird durch Zuschüsse von der Israel Science Foundation (1229-1207) und Deutsch-Israelische Projektkooperation (DIP-DFG) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 600E Multisolvent delivery System controller | Waters | WAT062710 | |
| Acetonitrile LiChrosolv (gradient grade for liquid chromatography) | Merck & Co., Inc. | 1.0003 | |
| Microcon Amicon Ultra 0.5 ml 30K or Centricon ultracel YM-30 | EMD Millipore | UFC503024 or 4208 | |
| Concentrator 5301, incl. 48 x 1.5 / 2.0 ml fixed-angle rotor | Eppendorf | 5301 000.016 | |
| Dialyzed F–tal Calf Serum | Biological Industries | 04-011-1A | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | GIBCO, by Life Technologies | 41965039 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - glucose free | Sigma-Aldrich | D5030 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D1408 | |
| EDTA disodium salt(Titriplex Iii) | Merck & Co., Inc. | 1084180250 | |
| Endo Hf Kit (1,000,000 units/ml) | New England Biolabs | p0703S | |
| F–tal Calf Serum (FCS) | Biological Industries | 04-001-1A | |
| Frac-100 fraction collector | Amersham | 18-1000-77 | |
| LS 6500 Liquid Scintillation Counting systems | Beckman Coulter Inc. | 510720 | |
| Mannose, D-[2-3H(N)]- (Specific Activity: 15-30Ci/mmol) | PerkinElmer, Inc. | NET570A | |
| N-carbobenzoxyl-leucinyl-leucinyl-leucinal (MG-132) | Calbiochem | 474790 | |
| N-glycosidase F (1000 units/ml) | Roche Group | 11365177 | |
| N-octylglucoside | Sigma-Aldrich | O3757 | |
| NIH 3T3 cells | American Type Culture Collection | CRL-1658 | |
| Opti-Flour | PerkinElmer, Inc. | 6013199 | |
| Phosphoric acid solution ( 49-51%, for HPLC) | Fluka | 79607 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | P2714 | |
| Protein A-Sepharose beads | Repligen | IPA300 | |
| Rabbit polyclonal anti-H2 carboxy-terminal 6 | |||
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | 30970 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Bio-Rad | 161-0301 | |
| Sodium phosphate | Sigma-Aldrich | 342483 | |
| Sodium pyruvate solution (100mM) | Sigma-Aldrich | S8636 | |
| Spherisorb NH2 Column, 5 μm, 4.6 x 250 mm | Waters | PSS831115 | |
| Triton X-100 | VWR | 306324N | |
| Vibra-Cell ultrasonic processors VCX 750 | Sonics and Materials, Inc. | 690-003 | |
| Buffer A: 1% Triton X-100, 0.5% w/v sodium deoxycholate, Protease inhibitor cocktail 2% v/v in PBS | |||
| Buffer B: 0.5% w/v SDS, Protease inhibitor cocktail 2% v/v in PBS | |||
| Buffer C: N-glycosidase F reaction buffer: 200mM Na3PO4, pH 8.0, 4mM EDTA, 1.5% N-octylglucoside | |||
| NIH 3T3 stably expressing H2a 6 | |||
| Buffer D: 0.5% Triton X-100, 0.25% w/v sodium deoxycholate,0.5% w/v SDS, Protease inhibitor cocktail 2% v/v in PBS | |||
| Buffer E: 0.5% w/v SDS, 1% v/v 2-Mercapt–thanol, Protease inhibitor cocktail 2% v/v in PBS | |||
| 2-mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M3148 |
References
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- Frenkel, Z., Gregory, W., Kornfeld, S., Lederkremer, G. Z. Endoplasmic reticulum-associated degradation of mammalian glycoproteins involves sugar chain trimming to Man6-5GlcNAc2. J Biol Chem. 278 (36), 34119-34124 (2003).
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