Summary
Dit artikel toont de dissectie en incubatie van konijnen netvlies en deeltjes-gemedieerde gen-overdracht van plasmiden die coderen voor GFP of een verscheidenheid van subcellulaire markers in de retinale ganglioncellen.
Abstract
Organotypische cultuur systemen van functionele neurale weefsels zijn belangrijke instrumenten in het neurobiologisch onderzoek. Idealiter zou een dergelijk systeem compatibel zijn met beeldvormende technieken, genetische manipulatie, en elektrofysiologische opname. Hier presenteren wij een eenvoudige interfase weefselkweek systeem voor volwassen konijnen netvlies dat er geen speciale apparatuur en zeer weinig onderhoud vereist. We tonen de dissectie en incubatie van konijnen netvlies en deeltjes-gemedieerde gen-overdracht van plasmiden die coderen voor GFP of een verscheidenheid van subcellulaire markers in de retinale ganglioncellen. Rabbit netvliezen gekweekt op deze manier levend gehouden kan worden voor maximaal 6 dagen met zeer weinig verandering van de totale anatomische structuur of de morfologie van de individuele ganglion-en amacrine cellen.
Protocol
Het maken van gen pistool kogels (GOLD)
- Maak 100X PVP (0.5mg/ml) in 100% EtOH.
- Weeg 30 mg van BioRad 1,6 Micron microdrager goud en plaats deze in een 1,5 ml Eppendorf buis.
- Bereken de hoeveelheid van de plasmide die nodig is om een concentratie van 0,5-3 ug plasmide / mg goud te geven, en plaats het plasmide in de buis met het goud microdragers. Combineer meerdere plasmiden indien nodig.
- Breng het volume van plasmide tot 100 ul met gedestilleerd water.
- Voeg 100 ul van 0,05 M spermidine in de buis. Vortex buis 30 seconden.
- Vortex 1 minuut op volle snelheid. Sonificeer 3-5 minuten ..
- Droog een juiste lengte van de buis Tefzel in een Biorad PDS-1000/He apparaat gedurende 15 minuten.
- Na sonicatie, vortex gedurende 1-2 minuten op volle snelheid. Verlaag de snelheid langzaam om de tube te openen tijdens het vortexen.
- Voeg 100 ul van 1 M CaCl 2 langzaam aan de buis druppelsgewijs tijdens het vortexen.
- Verlaat tube bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten.
- Maak 5 Micron filter.
- Neem twee 5 ml spuiten zonder naalden.
- Verwijder de zuiger, en verwijder de zwarte doppen. Het nemen van kleine schaar, sneed een deel van de zwarte kap om een ring te geven. Herhaal aan de andere zuiger net twee ringen.
- Sandwich een 5 micron (Small Parts, Inc nylon filter, ½ inch diameter) filter tussen de twee ringen, en de sandwich in de punt van de spuit te duwen.
- Bengelen spuit meer dan een 50 ml erlenmeyer.
- Na 10 minuten, vortex de buis gedurende 30 seconden.
- Centrifugeer de buis gedurende 30 seconden en bewaar de pellet.
- Voeg 1 ml van 100% EtOH tot pellet. Gebruik pipet tip te breken de korrel, en vortex 30 seconden. Spin 30 seconden en verwijder EtOH. Herhaal dit twee keer.
- Voeg 1 ml van 100% EtOH aan de pellet (break up met de tip). Plaats deze in de 5 Micron filter en laat het doorstromen door de zwaartekracht in de 50 ml conische buis. Gebruik meer EtOH als nodig is om spoelen buis of met flow te helpen door middel.
- Spin de 50 ml buis bij 2000 tpm in de centrifuge gedurende 5-10 minuten. Verwijder de bovenstaande vloeistof, op te slaan pellet.
- Afhankelijk van de gewenste dichtheid van het benodigde microdragers, voeg 800μl-1.5ml 100% EtOH en de bijbehorende 8 ul-15 ul PVP-oplossing.
- Swirl en onmiddellijk naar de Biorad PDS-1000/He apparaat.
- Biorad PDS-1000/He apparatuur
- Ontkoppel de buis die de N2 gas tank aan het drogen buis
- Haal het drogen Tefzel slangen van de machine
- Steek het ene uiteinde in de 50 ml conische buis, en bevestig een injectiespuit naar het andere uiteinde van de slang. Suck bruine brij in het midden van de buis.
- Plaats de slang terug in de machine.
- Wachten (zonder rotatie) gedurende 4 minuten
- Na 4 minuten, zuigen uit EtOH langzaam en voorzichtig, en zorg ervoor niet te microdragers storen.
- Draai de buis gedurende 1 minuut.
- Na 1 minuut, sluit de buis die de N 2 gas tank tot het drogen buis en laat de buizen drogen gedurende 15 minuten.
- Na 15 minuten, snijd de slang aan kogel grootte onmiddellijk worden gebruikt of opgeslagen bij 4 ° C in een exsiccator. Kogels kunnen worden opgeslagen tot 3 maanden.
De voorbereiding van gen-gun
- Plaats kogels in een cartridge. Elk stuk van het netvlies kan worden geschoten met 1-3 kogels.
- Plaats de cartridge in het gen-gun en bevestig het pistool aan een helium bron. Stel de druk tot 110 Psi.
Voorbereiding van de media
- Dissection medium
1 fles Ames-oplossing (Sigma, 8.8g) 1,9 gm natriumbicarbonaat 10 ml 1% pen / strep / L-Glutamine (1:100) (Gibco / Invitrogen) 990 ml gedestilleerd water toe 1L ------------------------------- 1 Liter - Filter de dissectie medium met behulp van een 0,22 urn filter.
- Incubatiemedium (500ml)
485 ml van gefilterde dissectie media 5 ml van 1% N2 supplement (Gibco / Invitrogen) 10 ml 1% paard serum (Sigma) 500 pi van fenol rood -------------------------------------------------- - 0,5 L - Filter de incubatie medium met behulp van een 0,22 urn filter.
- Bubble O 2 in de dissectie medium voor 15 minuten voor het begin van het netvlies harvesting protocol.
Voorbereiding van de incubatie kamers voor retina
- Onder een kap, vult u een aantal 60 mm diepe borden (incubatie kamers, Nunc) met 25 ml van incubatie medium. Het aantal schotels is afhankelijk van het aantal RETINAS nodig.
- Plaats een filter standaard in elke diepe schaal. Alleen de uiteinden van de stand mag niet worden ondergedompeld.
- Plaats alle diepe borden in de couveuse tot het netvlies klaar zijn.
- Vul twee 100 mm petrischalen en breng aan de dissectie bank.
De voorbereiding van konijn netvlies
- Offer een konijn volgens vaste protocollen. De volgende hoeft niet te worden uitgevoerd onder een kap.
- Met gebogen schaar, plaatst u deze achter het oog in de oogkas van het konijn, het snijden van de membranen en optische zenuw die zijn aangesloten op het oog.
- Til uit het oog en was het met zuurstofrijk dissectie media.
- Plaats het oog (hoornvlies naar boven gericht) in de put van een oog snijmachine en sluit het deksel.
- Plaats het mes horizontaal recht onder het deksel. In een vloeiende beweging, trek het blad over het oog af te snijden het hoornvlies, waardoor een oogschelp.
- Met behulp van een tang, het netvlies goed te verwijderen uit het oog snijmachine en plaats deze op een papieren filter.
- Verwijder het glasvocht en de lens door het klemmen van een gebied nabij de afgehakte oogzenuw en naar achteren te trekken op een filter papier. Herhaal dit meerdere keren totdat bijna al het glasvocht wordt verwijderd en het oog beker ziet er leeggelopen.
- Plaats oogschelp in een petrischaal met een dissectie media te wassen.
- Snijd het oog beker in het gewenste aantal stuks (maximaal 5 stuks).
- Neem een stuk van het oog kopje en plaats het onder de microscoop.
- Klem de sclera en vaatvlies lichtjes samen op de rand van het netvlies met behulp van een tang. Met de andere hand, met een fijne borstel te borstelen rechts tussen het vaatvlies en het netvlies.
- Met behulp van korte, zachte bewegingen, plagen het netvlies uit het vaatvlies totdat het loskomt.
- Snij een centimeter uit een steriele pipet overdracht. Gebruik dit om zuigen het netvlies en de plaats in een petrischaal van incubatiemedium te wassen.
- Met behulp van een andere steriele overdracht pipet met 1 inch afgesneden, zorgvuldig overdracht van de retina op een 0,4 um Millicell filter (Millipore, Cat No: PICMORG50).
- Gebruik een borstel te oriënteren het netvlies met de ganglion cel kant naar boven.
- Afvlakken het netvlies door borstelen licht op de randen van het netvlies. Minimaliseer het aanraken van het ganglion cel laag met de borstel zo veel mogelijk.
- Verwijder overtollig medium op filter met een transfer pipet.
- Met behulp van een tang, overdracht van de filter op een aangepaste suctioner. Teken op de suctioner 2-3 keer om alle incubatiemedium te verwijderen uit het filter.
Gene Gunning en incubatie van het netvlies
- Onder een kap, plaats van elk van de netvlies-bevattende-filters op het filter staat in de 60 mm diepe borden (incubatie kamers).
- Zorg ervoor dat het medium in contact staat met de onderkant van het filter en dat het medium niet spill over de zijkanten van de filter op het netvlies. Het filter moet fungeren als een interface tussen het netvlies en de medium.
- Schiet elk stuk van het netvlies met twee kogels. Plaats gen pistool direct boven weefsel, ongeveer 3-4 cm afstand.
- Plaats alle incubatie kamers op een shaker in de 35 - 37 ° C incubator.
- Vervangen met incubatiemedium elke dag. Het netvlies kan worden geïncubeerd voor maximaal 6 dagen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
1. Wat kan ik doen met deze methode?
- Duidelijk te zien cel morfologie.
- Label cellen op te nemen van hen.
- Overexpressie van eiwitten, zoals PSD95, maar ook andere eiwitten die de cel reactie te moduleren, zoals ion kanalen, receptoren.
- Express remmende RNAs.
2. Hoe lang kan ik blijven volwassen netvlies?
- 4 dagen is geen probleem voor volwassen konijn. Na zes dagen van de cellen look "ziek", dwz de axonen trekken, zie je zwelling van dendrieten en de opname van het licht de reacties wordt onbetrouwbaar (slechts ~ 50% van de cellen bleken licht reagerende na die tijd.
- We hielden de muis netvliezen voor 2 dagen. Muizen zijn moeilijker, omdat de netvlies zijn gevasculariseerd, en ook dikker dan konijn netvlies.
3. Hoe zorg ik ervoor zorgen dat uw netvlies gezond is na deze tijd?
- De gouden standaard is de opname van hen. Ganglioncellen moet nog steeds reageren op licht. U moet beschermen weefsel van licht tijdens de incubatie om te voorkomen dat het bleken van de photopigment, want je moet het netvlies ontleden uit het pigment epitheel voor incubatie.
- We af en toe ook gebruikt voor micro-elektrode-array opname op ons netvlies te testen.
4. Waarom wil je maar een paar cellen in het netvlies op een moment te manipuleren?
- Sommige vragen kunnen niet anders worden aangepakt. Denk bijvoorbeeld aan GABA-receptoren op een ganglion cel. Je zou kunnen gebruiken GABA-blokkers, maar je zou alle GABA-erge transmissie in het netvlies remmen, niet alleen de ingang naar de cel waarin u bent geïnteresseerd Het kan erg moeilijk om onderscheid te maken tussen een effect op die cel in het bijzonder, en de algehele 'netwerk-effecten "op het hele netvlies.
- Wilt u de morfologie duidelijk te zien, kun je niet alle cellen label, anders krijg je alleen maar een puinhoop.
5. Is deze methode geschikt is als een populatie vlek?
- Nee Gene gemunt is een willekeurige procedure. Je krijgt veel ganglioncellen, veel ontheemden amacrine cellen, sommige Muller cellen, en veel minder van alle andere celtypen.
6. Zijn er "trucs" Ik moet weten om het te laten werken?
- Niet echt. Maar het is belangrijk dat u de dissectie van het netvlies te doen relatief snel, zodat u uw stukken op het filter in minder dan 30 minuten. De stukken moeten niet te klein zijn, ongeveer een vierkante centimeter ok is. Verwacht 3-4 stukken van een konijn oog.
- Houd uw dissectie-instrumenten strikt weg van alles wat in contact komt met fixatieven en andere agressieve chemicaliën.
- Probeer het instellen van uw incubator tot 35 ° C in plaats van 37, zodat het netvlies wordt nooit te heet.
- U hoeft niet te groeifactoren toe te voegen zoals BDNF uw medium, tenminste we het niet routinematig te doen, maar je moet N2 supplement, 1% paard serum, en antibiotica te gebruiken. Wij bieden een overzicht van alle dingen die je & 'nodig hebt als een aanvullend bestand naar deze documentatie.
7. Kun je gen-gun andere dingen, in plaats van plasmiden?
- Ja, we hebben gebruikt dye-geconjugeerde dextranen of DII en Dio. Maar je zou kunnen gebruiken calcium-indicator kleurstoffen, of vrijwel alles wat je kunt jas op goud of wolfraam kogels.
8. Wat zijn de beperkingen?
- In de eerste plaats, tijd. Je moet de oogzenuw, wat betekent dat de ganglion cellen zullen uiteindelijk degenereren snijden. Dit is geen probleem voor maximaal 6 dagen, maar na dat we geen vertrouwen in de retina's niet meer. Nu, als je gewoon wilt GFP of express een andere cel vullen marker, een incubatie van 2-3 dagen is genoeg, maar in sommige gevallen, zoals wanneer je wilt remmende RNAs te uiten, is het effect kan vier of meer dagen show. Hier moet u de tijdlijn in gedachten te houden.
9. Welke andere onderzoekers het werk moet men zich bewust van?
- In het netvlies veld, zeker Rachel Wong's lab aan de Washington University. Er is ook veel werk mensen hebben gedaan in andere systemen, zoals de hippocampus slice voorbereiding. We pretenderen niet in staat om een volledig overzicht van de literatuur te geven, maar bekijk de kranten in de referenties lijst.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
References
- Landreth,, Agranoff, B. W. Explant culture of adult goldfish retina: a model for the study of CNS regeneration. Brain Res. 161, 39-55 (1979).
- Smalheiser, N. R., Crain, S. M., Bornstein, M. B. Development of ganglion cells and their axons in organized cultures of fetal mouse retinal explants. Brain Res. 204, 159-178 (1981).
- Adler, R., Magistretti, P. J., Hyndman, A. G., Shoemaker, W. J. Purification and cytochemical identification of neuronal and non-neuronal cells in chick embryo retina cultures. Dev Neurosci. 5, 27-39 (1982).
- Rehm, H., Schafer, T., Betz, H. Beta-bungarotoxin-induced cell-death of neurons in chick retina. Brain Res. 250, 309-319 (1982).
- Kim, S. U., Takahashi, H. Tissue culture study of adult human retina neurons. Invest Ophthalmol Vis Sci. 29, 1372-1379 (1988).
- Caffe, A. R., Soderpalm, A., van Veen, T. Photoreceptor-specific protein expression of mouse retina in organ culture and retardation of rd degeneration in vitro by a combination of basic fibroblast and nerve growth factors. Curr Eye Res. 12, 719-726 (1993).
- Wong, H. C., Thompson, S., Yu, D. Y., Cringle, S. J., Alder, V. A., Taylor, S. J. Comparison of growth rates of bovine retinal and brain microvascular pericytes in different oxygen concentrations in vitro. Aust N Z J Ophthalmol. 23, 299-308 (1995).
- Seigel, G. M. The golden age of retinal cell culture. Mol Vis. 5, 4 (1999).
- Caffe, A. R., Ahuja, P., Holmqvist, B., Azadi, S., Forsell, J., Holmqvist, I., et al. Mouse retina explants after long-term culture in serum free medium. J Chem Neuroanat. 22, 263-273 (2001).
- Hatakeyama, J., Kageyama, R. Retrovirus-mediated gene transfer to retinal explants. Methods. 28, 387-395 (2002).
- Zhang, S. S., Fu, X. Y., Barnstable, C. J. issue culture studies of retinal development. Methods. 28, 439-447 (2002).
- Wang, S. W., Mu, X., Bowers, W. J., Klein, W. H. Retinal ganglion cell differentiation in cultured mouse retinal explants. Methods. 28, 448-456 (2002).
- Inoue, T., Hojo, M., Bessho, Y., Tano, Y., Lee, J., Kageyama, R. Math3 and NeuroD regulate amacrine cell fate specification in the retina. Development. 129, 831-842 (2002).
- Kretz, A., Hermening , S. H., Isenmann , S. A novel primary culture technique for adult retina allows for evaluation of CNS axon regeneration in rodents. J Neurosci Methods. 136, 207-219 (2004).
- Liljekvist-Larsson, I., Johansson, K. Retinal neurospheres prepared as tissue for transplantation. Brain Res Dev Brain Res. 160, 194-202 (2005).
- Reidel, B., Orisme, W., Goldmann, T., Smith, W. C., Wolfrum, U. Photoreceptor vitality in organotypic cultures of mature vertebrate retinas validated by light-dependent molecular movements. Vision Res. 46, 4464-4471 (2006).
- Xin, H., Yannazzo, J. A., Duncan, R. S., Gregg, E. V., Singh, M., Koulen, P. A novel organotypic culture model of the postnatal mouse retina allows the study of glutamate-mediated excitotoxicity. J Neurosci Methods. 159, 35-42 (2007).
- Johnston, S. A., Tang, D. C. The use of microparticle injection to introduce genes into animal cells in vitro and in vivo. Genet Eng (N Y). 15, 225-236 (1993).
- Lo, D. C., McAllister, A. K., LC, K. atz Neuronal transfection in brain slices using particle-mediated gene transfer. Neuron. 13, 1263-1268 (1994).
- Rajagopalan, L. E., Malter, J. S. Turnover and translation of in vitro synthesized messenger RNAs in transfected, normal cells. J Biol Chem. 271, 19871-19876 (1996).
- McAllister, A. K.
- Gan, W. -B., Grutzendler, J., Wong, W., Wong, R., Lichtman, J. Multicolor "DiOlistic" labeling of the nervous system using lipophilic dye combinations. Neuron. 27, 219-225 (2000).
- Sato, H., Hattori, S., Kawamoto, S., Kudoh, I., Hayashi, A., Yamamoto, I., et al. In vivo gene gun-mediated DNA delivery into rodent brain tissue. Biochem Biophys Res Commun. 270, 163-170 (2000).
- Zhang, G., Selzer, M. E. In vivo transfection of lamprey brain neurons by gene gun delivery of DNA. Exp Neurol. 167, 304-311 (2001).
- Sohn, R. L., Murray, M. T., Schwarz, K., Nyitray, J., Purray, P., Franko, A. P., et al. In-vivo particle mediated delivery of mRNA to mammalian tissues: ballistic and biologic effects. Wound Repair Regeneration. 209, 287-296 (2001).
- O'Brien, J. A., Holt, M., Whiteside, G., Lummis, S. C., Hastings, M. H. Modifications to the hand-held Gene Gun: improvements for in vitro biolistic transfection of organotypic neuronal tissue. J Neurosci Methods. 112, 57-64 (2001).
- Klimaschewski, L., Nindl, W., Pimpl, M., Waltinger, P., Pfaller, K. Biolistic transfection and morphological analysis of cultured sympathetic neurons. J Neurosci Methods. 113, 63-71 (2002).
- Kettunen, P., Demas, J., Lohmann, C., Kasthuri, N., Gong, Y., Wong, R. O., et al. Imaging calcium dynamics in the nervous system by means of ballistic delivery of indicators. J Neurosci Methods. 11, 37-43 (2002).
- Gamper, N., Shapiro, M. S. Calmodulin mediates Ca2+-dependent modulation of M-type K+ channels. J Gen Physiol. 122, 17-31 (2003).
- Wirth, M. J., Wahle, P. Biolistic transfection of organotypic cultures of rat visual cortex using a handheld device. J Neurosci Methods. 125, 45-54 (2003).
- O'Brien, J., Lummis, S. C. Biolistic and diolistic transfection: using the gene gun to deliver DNA and lipophilic dyes into mammalian cells. Methods. 33, 121-125 (2004).
- Benediktsson, A. M., Schachtele, S. J., Green, S. H., Dailey, M. E. Ballistic labeling and dynamic imaging of astrocytes in organotypic hippocampal slice cultures. J Neurosci Methods. 141, 41-53 (2005).
- Chow, L., Levine, E. M., Reh, T. A. The nuclear receptor transcription factor, retinoid-related orphan receptor beta, regulates retinal progenitor proliferation. Mech Dev. 77, 149-164 (1998).
- Rockhill, R. L., Daly, F. J., MacNeil, M. A., Brown, S. P., Masland, R. H. The diversity of ganglion cells in a mammalian retina. J Neurosci. 22, 3831-3843 (2002).
- Sun, W., Li, N., He, S. Large-scale morphological survey of mouse retinal ganglion cells. J Comp Neurol. 451, 115-126 (2002).
- Sun, W., Li, N., He, S. Large-scale morophological survey of rat retinal ganglion cells. Vis Neurosci. 2019, 483-493 (2002).
- Stacy, R. C., Wong, R. O. Developmental relationship between cholinergic amacrine cell processes and ganglion cell dendrites of the mouse retina. J Comp Neurol. 456, 154-166 (2003).
- Strettoi, E., Pignatelli, V., Rossi, C., Porciatti, V., Falsini, B. Remodeling of second-order neurons in the retina of rd/rd mutant mice. Vision Res. 43, 867-877 (2003).
- Pignatelli, V., Strettoi, E. Bipolar cells of the mouse retina: a gene gun, morphological study. J Comp Neurol. 476, 254-266 (2004).
- Connaughton, V. P., Graham, D., Nelson, R. Identification and morphological classification of horizontal, bipolar, and amacrine cells within the zebrafish retina. J Comp Neurol. 477, 371-385 (2004).
- Edqvist, P. H., Hallbook, F. Newborn horizontal cells migrate bi-directionally across the neuroepithelium during retinal development. Development. 131, 1343-1351 (2004).
- Jakobs, T. C., Libby, R. T., Ben, Y., John, S. W., Masland, R. H. Retinal ganglion cell degeneration is topological but not cell type specific in DBA/2J mice. J Cell Biol. 171, 313-325 (2005).
- Qin, Y., Xu, G., Wang, W. Dendritic abnormalities in retinal ganglion cells of three-month diabetic rats. Curr Eye Res. 31, 967-974 (2006).
- Roizenblatt, R., Weiland, J. D., Carcieri, S., Qiu, G., Behrend, M., Humayun, M. S. Nanobiolistic delivery of indicators to the living mouse retina. J Neurosci Methods. 153, 154-161 (2006).
- Koizumi, A., Zeck, G., Ben, Y., Masland, R. H., Jakobs, T. C. Organotypic culture of physiologically functional adult Mammalian retinas. PLoS ONE. 2, e221 (2007).
