Ontwikkeling van geautomatiseerde beeldvorming en analyse voor de zebravis chemische schermen.

Summary

Wij rapporteren de ontwikkeling van een systeem voor geautomatiseerde beeldvorming en analyse van transgene zebravis embryo's in multiwell platen. Dit toont de mogelijkheid om dosisafhankelijke effecten van een klein molecuul, BCI, meten op fibroblast groeifactor reporter-gen expressie en leveren van technologie voor de oprichting van high-throughput zebravis chemische schermen.

Abstract

Tonen we de toepassing van beeld-gebaseerde high-content screening (HCS) methodologie om kleine moleculen die de FGF / RAS / MAPK route kan moduleren in de zebravis embryo's te identificeren. De zebravis embryo is een ideaal systeem voor in vivo high-content chemische schermen. De 1-dag oud embryo is ongeveer 1 mm in diameter en kan gemakkelijk worden geschaard in 96-well platen, een standaard formaat voor high throughput screening. Tijdens de eerste dag van de ontwikkeling, de embryo's zijn transparant met de meeste van de belangrijkste organen aanwezig is, waardoor visualisatie van weefsel de vorming tijdens de embryogenese. De volledige automatisering van zebravis chemische schermen is nog steeds een uitdaging, maar met name in de ontwikkeling van geautomatiseerde afbeelding acquisitie en analyse. We hebben eerder geleid tot een transgene verslaggever lijn die groen fluorescerend eiwit (GFP) tot uitdrukking onder de controle van FGF activiteit en hun nut bewezen in de chemische-schermen

Protocol

1) Opzetten van zebravis paringen en BCI behandeling.

1. Twee dagen voorafgaand aan de behandeling, te identificeren homozygote mannen Tg (dusp6: d2eGFP) ^PT6 zebravis en plaats individueel in de paring tanks ^1. Voeg afscheider en een wild-type AB * vrouwelijke vissen en 's nachts vertrekken paring kooien.
2. De volgende morgen te verwijderen van de afscheider, en het verzamelen van embryo's na 1 uur. Transfer embryo's tot 100mm gerechten met E3 (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4), oplossing en incubeer bij 28 ° C gedurende 6 uur. Verwijderen dode en onbevruchte embryo's, voeg verse E3 oplossing en incubeer overnacht.
3. Sorteer transgene embryo's voor soortgelijke fase (24hpf) en uniforme GFP expressie. Array embryo's individueel in elke well van een 96-well plaat.
4. Verwijder overtollig E3 oplossing met een micropipet. Voeg 200μl van de E3-oplossing met een multi-channel pipet in elk putje.
5. Voeg de volgende verbindingen zoals vermeld:
   
   

   1

   2

   3

   4

   5

   6

   7

   8

   9

   10

   11

   12

   Een

   2μl DMSO

   2μl BCl (0.1mm)

   2μl BCl (0,5 mm)

   2μl BCl (1mm)

   2μl BCl (2mm)

   2μl BCl (2,5 mm)

   2μl BCl (0.1mm)

   2μl BCl (0,5 mm)

   2μl BCl (1mm)

   2μl BCl (2mm)

   2μl BCl (2,5 mm)

   2μl DMSO

   B

   2μl DMSO

   2μl BCl (0.1mm)

   2μl BCl (0,5 mm)

   2μl BCl (1mm)

   2μl BCl (2mm)

   2μl BCl (2,5 mm)

   2μl BCl (0.1mm)

   2μl BCl (0,5 mm)

   2μl BCl (1mm)

   2μl BCl (2mm)

   2μl BCl (2,5 mm)

   2μl DMSO

   C

   2μl DMSO

   2μl BCl (0.1mm)

   2μl BCl (0,5 mm)

   2μl BCl (1mm)

   2μl BCl (2mm)

   2μl BCl (2,5 mm)

   2μl BCl (0.1mm)

   2μl BCl (0,5 mm)

   2μl BCl (1mm)

   2μl BCl (2mm)

   2μl BCl (2,5 mm)

   2μl DMSO

   D

   2μl DMSO

   2μl BCl (0.1mm)

   2μl BCl (0,5 mm)

   2μl BCl (1mm)

   2μl BCl (2mm)

   2μl BCl (2,5 mm)

   2μl BCl (0.1mm)

   2μl BCl (0,5 mm)

   2μl BCl (1mm)

   2μl BCl (2mm)

   2μl BCl (2,5 mm)

   2μl DMSO

   E

   2μl DMSO

   2μl BCl (0.1mm)

   2μl BCl (0,5 mm)

   2μl BCl (1mm)

   2μl BCl (2mm)

   2μl BCl (2,5 mm)

   2μl BCl (0.1mm)

   2μl BCl (0,5 mm)

   2μl BCl (1mm)

   2μl BCl (2mm)

   2μl BCl (2,5 mm)

   2μl DMSO

   F

   2μl DMSO

   2μl BCl (0.1mm)

   2μl BCl (0,5 mm)

   2μl BCl (1mm)

   2μl BCl (2mm)

   2μl BCl (2,5 mm)

   2μl BCl (0.1mm)

   2μl BCl (0,5 mm)

   2μl BCl (1mm)

   2μl BCl (2mm)

   2μl BCl (2,5 mm)

   2μl DMSO

   G

   2μl DMSO

   2μl BCl (0.1mm)

   2μl BCl (0,5 mm)

   2μl BCl (1mm)

   2μl BCl (2mm)

   2μl BCl (2,5 mm)

   2μl BCl (0.1mm)

   2μl BCl (0,5 mm)

   2μl BCl (1mm)

   2μl BCl (2mm)

   2μl BCl (2,5 mM)

   2μl DMSO

   H

   2μl DMSO

   2μl BCl (0.1mm)

   2μl BCl (0,5 mm)

   2μl BCl (1mm)

   2μl BCl (2mm)

   2μl BCl (2,5 mm)

   2μl BCl (0.1mm)

   2μl BCl (0,5 mm)

   2μl BCl (1mm)

   2μl BCl (2mm)

   2μl BCl (2,5 mm)

   2μl DMSO

   Eindconcentraties zijn 1 uM, 5 urn, 10μM, 20μM, 25μM BCI in 1% DMSO. Afdekplaat in aluminium folie en incubeer gedurende 6 uur bij 28 ° C.

2) Geautomatiseerde beeldvorming van 96-wells platen en analyse.

1. Voeg 10μl van tricaïne (0.61mM) aan elk putje te 30hpf embryo's verdoven.
2. Laad plaat in Molecular Devices Imagexpress Ultra.
3. Open Metaxpress software. Kies een configuratie met een 4x objectieve en maximale pinhole diameter, configureren laser autofocus tot op het bord bodem te detecteren, en bepalen een optimale Z-vliegtuig naar gebieden van belang op te sporen. Acquire beelden bij excitatie / emissie golflengtes van 488 / 525 nm (GFP). Stel scan gebied als een enkele site van 2000x2000 pixels (4 x 4 mm) zonder binning. Configureren laservermogen en krijgen zodanig dat helderste regio's in positieve controle beelden niet te verzadigen. Bevestig de juiste beeldacquisitie in verschillende positieve en negatieve controle putten.
4. Start plaat scan. Het instrument zal automatisch verwerven beelden van alle putten en archiveren in een SQL server database.
5. Upload beelden in Definiens Developer met behulp van de Cellenger applicatie module en een import filter dat beeldformaat en bestandsstructuur gegenereerd door de Molecular Devices Imagexpress Ultra-platform herkent.
6. Proces beelden met een speciaal ontworpen Cognition Network Technology-algoritme (ook wel een regelset). Het algoritme, die wij op maat ontwikkeld op basis van een recent gepubliceerde regelset ^2, is ontworpen om automatisch te identificeren embryo, dooier, en hoofd, en om de helderheid en het gebied van GFP-expressie hoofd structuren te kwantificeren. Wells waarin geen embryo is geconstateerd of waar het hoofd niet ondubbelzinnig kan worden toegekend (bijvoorbeeld met een hoge toxiciteit compound of onscherp beelden) zijn uitgesloten van de analyse. Configureer het algoritme met behulp van een aantal negatieve controle foto's (voertuig behandeld) en de positieve controle beelden (BCI behandeld) zodanig dat het hoofd en de dooier correct worden geïdentificeerd in beide. Stel een 'head-structuren "detectiedrempel als een veelvoud van de gemiddelde intensiteit dooier tot detectie van heldere structuren hoofd wedstrijden visuele waarneming. Parameters definiëren om te exporteren. In dit voorbeeld is de meest informatieve parameter was de totale geïntegreerde helderheid van GFP-positieve regio's in het hoofd, hierna genoemd "total head-structuren helderheid" (Figuur 1).
   
   
   Figuur 1
   Grafiek depicitng De dosis-afhankelijke effecten van BCI op de GFP expressie in transgene embryo's.
7. Voer het algoritme op alle plaat beelden met behulp van de geïntegreerde job scheduler. De Definiens software maakt gebruik van distributed computing op meerdere processoren ("motoren"), waardoor gelijktijdige analyse van meerdere afbeeldingen. Het algoritme berekent de numerieke maatregelen op basis van de resultaten van de beeldanalyse, die worden opgeslagen in de database samen met een kopie van het bewerkte beeld, met een analyse toegepast.

Representatieve resultaten:

Nadat alle beelden worden geanalyseerd, kunnen de gegevens worden gevisualiseerd in Cellenger of geëxporteerd naar software van derden (Excel, GraphPad Prism) voor verdere analyse en grafische weergave. Figuur 2 toont gearchiveerde afbeeldingen scannen van behandelde een voertuig en een goed BCI-behandeld, met en zonder CNT-analyse toegepast. Figuur 1 documenten een dosis-afhankelijke effect van de BCI op de GFP-reporter genexpressie in Tg (dusp6: d2EGFP) ^PT6 embryo's. De concentratie nodig is om een ​​half maximale respons (EC50) te lokken was ongeveer 12 uM.


Figuur 2
Automatische foto-opname en analyse van transgene zebravis embryo's. (A) DMSO voertuig behandeld Tg (dusp6: d2eGFP) ^PT6 embryo op 30hpf. (B) transgene embryo's die werden behandeld met 20μM BCI tonen toename van GFP expressie. (C) Afbeelding van embryo's van (A) na het draaien van Definiens regelset om GFP tot uitdrukking komen in het hoofd. Oranje vlekken aan te duiden waar de software GFP intensiteit van maatregelen. (D) Afbeelding van embryo's uit (B) na het draaien van Definiens regelset om GFP tot uitdrukking komen in het hoofd. Oranje vlekken aan te duiden waar de software GFP intensiteit van maatregelen. Merk op dat de regelset in staat was om een ​​uitgebreide gebied van GFP tot uitdrukking komen in de behandelde embryo.

Discussion

Een belangrijke factor die de doorvoer van de zebravis chemische schermen is het gebrek aan methodiek om systematisch te verwerken 96-well platen voor beeldvorming en analyse. Omdat beelden van meercellige organismen zijn complexe, laag contrast, en heterogeen van aard, bestaande beeldanalyse algoritmen niet te detecteren en te kwantificeren specifieke structuren in het organisme. De meeste gepubliceerde zebravis chemische schermen dus mogelijk voor visueel onderzoek van de individuele putten door toegewijde personeel tijdens de gehele procedure. Dit voorkomt meestal de generatie van numerieke uitlezingen en een volledige archivering van het scherm beelden en gegevens. Bovendien, handmatige evaluatie elimineert een aantal belangrijke voordelen van het image-based screening, namelijk de mogelijkheid om retrospectieve analyses van het scherm de prestaties te voeren, om fenotypische veranderingen die niet de primaire focus van de screening campagne (bv. toxiciteit of defecten in de ontwikkeling) het onderzoeken en over te steken -referentie-screening van gegevens met het verleden of de toekomst schermen met dezelfde compound bibliotheek.

In dit rapport belichten we de methodologie voor automatische beeldvorming en analyse van de zebravis embryo's in multiwell platen zonder tussenkomst van de gebruiker. We automatische beeld vast te leggen op een ImageXpress Ultra confocale laser scanning lezer (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) om beeld Tg (dusp6: d2EGFP) ^PT6 embryo's in 96 wells platen en ontwikkelde een beeldanalyse algoritme gebaseerd op Cognition Definiens 'Network Technology gekwantificeerde GFP uitdrukking in de hoofden van transgene embryo's. De methode geleverd gesorteerd reacties en gekwantificeerd de in vivo activiteit van een klein molecuul activator van FGF signalering. Vergelijkbare resultaten werden verkregen met de epifluorescentie-based ArrayScan II (Cellomics Inc, Pittsburgh PA) waaruit blijkt dat het mogelijk is om geautomatiseerde beeldopname van de zebravis embryo's uitvoeren op een verscheidenheid van commercieel beschikbare plaat lezers ^2. De ontwikkeling van de methodologie voor het automatisch analyseren van meercellig organisme beelden niet langer nodig voor visuele scoren door een menselijke waarnemer en in staat het genereren en archiveren van numerieke gegevens en beelden voor de retrospectieve analyse en vergelijkingen met toekomstige schermen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tricaine (MS222)	Sigma-Aldrich	Cat.# A-5040