Summary
我々は、マルチウェルプレートのゼブラフィッシュ遺伝子導入胚の自動化された画像と解析のためのシステムの開発について報告する。これは、線維芽細胞成長因子のレポーター遺伝子の発現に低分子化合物、BCI、の用量依存性の効果を測定し、高スループットのゼブラフィッシュの化学物質の画面を確立するための技術を提供する能力を示しています。
Abstract
我々は、ゼブラフィッシュの胚ではFGF / RAS / MAPK経路を調節できる小さな分子を識別するためのイメージベースのハイコンテンツスクリーニング（HCS）方法論の適用を示しています。ゼブラフィッシュの胚は、生体内の高含有量化学物質の画面で最適なシステムです。 1日齢の胚は、直径1mm程度であり、簡単に96ウェルプレート、ハイスループットスクリーニングのための標準形式に配列することができます。開発の最初の日の間に、胚は、このように、胚発生時の組織形成の可視化を可能にする、現在の主要な臓器のほとんどが透明です。ゼブラフィッシュの化学画面の完全な自動化は、特に自動化されたイメージの取得と分析の開発では、しかしながら、依然として課題です。我々は以前にFGF活性の制御下に緑色蛍光タンパク質（GFP）を発現するトランスジェニックレポーターのラインを生成し、化学物質の画面でその有用性を実証
Protocol
1）ゼブラフィッシュの交配とBCIの治療を設定します。
- 個別に交配タンク1内にPT6ゼブラフィッシュと場所：2日前治療に、ホモ接合体の雄Tgを（d2eGFP dusp6）識別する。セパレータと野生型AB *メスの魚を追加し、一晩交配ケージに残す。
- 翌朝には、区切り文字を削除し、そして1時間後に胚を収集する。 E3（5 mMのNaCl、0.17 mMの塩化カリウム、0.33 mMの塩化カルシウム、0.33 mMの硫酸マグネシウム）、6時間28℃で溶液とインキュベートして100ミリメートル皿に胚を移す。死んで削除し、胚を不受精の、新鮮なE3のソリューションを追加し、そして一晩インキュベートする。
- 同じようなステージ（24hpf）と均一なGFPの発現のためのトランスジェニック胚を並べ替えます。 96ウェルプレートの各ウェルに個別に配列の胚。
- マイクロピペットによる過剰E3ソリューションを削除します。各ウェルにマルチチャンネルピペッターを持つE3ソリューションの200μlの追加。
- として記載されている以下の化合物を追加します。
最終濃度は1％DMSOで1μM、5μM、10μM、20μM、25μmのBCIです。アルミ箔でプレートをカバーし、28で6時間インキュベート℃を1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A 2μlの
DMSO2μlの
BCL
（0.1mm単位）2μlの
BCL
（0.5）2μlの
BCL
（1mm）の2μlの
BCL
（2mm以上）2μlの
BCL
（2.5MM）2μlの
BCL
（0.1mm単位）2μlの
BCL
（0.5）2μlの
BCL
（1mm）の2μlの
BCL
（2mm以上）2μlの
BCL
（2.5MM）2μlの
DMSOB 2μlの
DMSO2μlの
BCL
（0.1mm単位）2μlの
BCL
（0.5）2μlの
BCL
（1mm）の2μlの
BCL
（2mm以上）2μlの
BCL
（2.5MM）2μlの
BCL
（0.1mm単位）2μlの
BCL
（0.5）2μlの
BCL
（1mm）の2μlの
BCL
（2mm以上）2μlの
BCL
（2.5MM）2μlの
DMSOC 2μlの
DMSO2μlの
BCL
（0.1mm単位）2μlの
BCL
（0.5）2μlの
BCL
（1mm）の2μlの
BCL
（2mm以上）2μlの
BCL
（2.5MM）2μlの
BCL
（0.1mm単位）2μlの
BCL
（0.5）2μlの
BCL
（1mm）の2μlの
BCL
（2mm以上）2μlの
BCL
（2.5MM）2μlの
DMSOD 2μlの
DMSO2μlの
BCL
（0.1mm単位）2μlの
BCL
（0.5）2μlの
BCL
（1mm）の2μlの
BCL
（2mm以上）2μlの
BCL
（2.5MM）2μlの
BCL
（0.1mm単位）2μlの
BCL
（0.5）2μlの
BCL
（1mm）の2μlの
BCL
（2mm以上）2μlの
BCL
（2.5MM）2μlの
DMSOE 2μlの
DMSO2μlの
BCL
（0.1mm単位）2μlの
BCL
（0.5）2μlの
BCL
（1mm）の2μlの
BCL
（2mm以上）2μlの
BCL
（2.5MM）2μlの
BCL
（0.1mm単位）2μlの
BCL
（0.5）2μlの
BCL
（1mm）の2μlの
BCL
（2mm以上）2μlの
BCL
（2.5MM）2μlの
DMSOF 2μlの
DMSO2μlの
BCL
（0.1mm単位）2μlの
BCL
（0.5）2μlの
BCL
（1mm）の2μlの
BCL
（2mm以上）2μlの
BCL
（2.5MM）2μlの
BCL
（0.1mm単位）2μlの
BCL
（0.5）2μlの
BCL
（1mm）の2μlの
BCL
（2mm以上）2μlの
BCL
（2.5MM）2μlの
DMSOG 2μlの
DMSO2μlの
BCL
（0.1mm単位）2μlの
BCL
（0.5）2μlの
BCL
（1mm）の2μlの
BCL
（2mm以上）2μlの
BCL
（2.5MM）2μlの
BCL
（0.1mm単位）2μlの
BCL
（0.5）2μlの
BCL
（1mm）の2μlの
BCL
（2mm以上）2μlの
BCL
（2.5メートルM）2μlの
DMSOH 2μlの
DMSO2μlの
BCL
（0.1mm単位）2μlの
BCL
（0.5）2μlの
BCL
（1mm）の2μlの
BCL
（2mm以上）2μlの
BCL
（2.5MM）2μlの
BCL
（0.1mm単位）2μlの
BCL
（0.5）2μlの
BCL
（1mm）の2μlの
BCL
（2mm以上）2μlの
BCL
（2.5MM）2μlの
DMSO
96ウェルプレートおよび分析の2）自動化イメージング。
- 30hpf胚を麻酔するために各ウェルにtricaine（0.61mM）の10μlを追加します。
- 分子デバイスImagexpressウルトラにプレートをロードする。
- Metaxpressソフトウェアを開きます。 4xの客観的かつ最大のピンホールの直径を持つ構成を選択し、レーザーオートフォーカスは、プレートの底部を検出し、関心領域を検出するために最適なZ -平面を決定するために設定する。 525分の488 nmの（GFP）の励起/発光波長での画像を取得する。ないビニングと2000x2000ピクセル（4 × 4 mm）の単一のサイトとして領域をスキャン設定する。レーザーパワーを設定し、ポジティブコントロールイメージのように明るい領域が飽和していない得る。いくつかのポジティブおよびネガティブコントロールのウェル内の適切な画像の取得を確認してください。
- プレートのスキャンを開始します。測定器は自動的にすべてのウェルとアーカイブするSQL Serverデータベース内から画像を取得します。
- Cellengerアプリケーションモジュールと分子デバイスImagexpressウルトラプラットフォームで生成される画像形式とファイル構造を認識するインポートフィルタを使用して定義するものの開発者向けに画像をアップロードする。
- カスタム設計された認知ネットワーク技術のアルゴリズム（これもルールセットと呼ばれる）を持つプロセスの画像。我々のカスタムは、最近発表されたルールセット2に基づいて開発されたアルゴリズムは、自動的に胚、卵黄、そして頭を識別するために設計されており、GFP発現ヘッド構造の明るさと面積を定量化する。 （例えば、フォーカス画像の高い化合物の毒性または外付）は胚が検出されているか、ヘッドを明確に割り当てることができない場所ウェルは分析から除外されます。いくつかのネガティブコントロールイメージ（ビヒクル処理）と陽性対照の画像（BCI処理）頭と卵黄が正しく両方で識別されるように使用するアルゴリズムを設定します。明るいヘッド構造の検出は目視観察と一致するまでの平均卵黄の強度の倍数として"頭の構造が"検出のしきい値を設定します。エクスポートするパラメータを定義します。この例では、最も有益なパラメータは以下、"総頭の構造の輝度"（図1）と呼ばれるヘッド内でGFP -陽性領域の全積分明るさだった。
図1
グラフは、トランスジェニック胚におけるGFPの発現にBCIの用量依存性の影響をdepicitng。 - 統合されたジョブスケジューラを使用して、すべてのプレートの画像上でアルゴリズムを実行します。定義するもののソフトウェアは、複数の画像の同時分析を可能にする、複数のプロセッサ（"エンジン"）で分散コンピューティングを使用しています。アルゴリズムでは、応用解析と処理された画像のコピーと一緒にデータベースに保存されている画像解析、、の結果に基づいて数値の措置を計算します。
代表的な結果：
すべての画像が分析された後、データはCellenger内で可視化することや、さらに詳しい分析やグラフ表示のためのサードパーティソフトウェア（エクセル、グラフパッドプリズム）にエクスポートできます。図2は、治療を受けた車両からのスキャン画像をアーカイブし、適用されたとCNTの分析せずに、よくBCI -扱わ。図1文書TgのGFPレポーター遺伝子の発現（dusp6：d2EGFP）でBCIの用量依存効果PT6胚。半最大応答（EC50）を引き出すために必要な濃度は約12μmであった。 
図2
トランスジェニックゼブラフィッシュの胚の自動化されたイメージのキャプチャと分析。 30hpfでPT6胚：（A）DMSOの車両は、Tg（d2eGFP dusp6）を扱う。 （B）20μMBCIショーで治療したトランスジェニック胚では、GFPの発現で増加する。頭の中でGFPの発現を検出するルールセット定義するものを実行した後から胚（）の（C）画像。オレンジ色の斑点は、ソフトウェアがGFPの強度を測定する場所表す。頭の中でGFPの発現を検出するルールセット定義するものを実行した後（B）からの胚の（D）イメージ。オレンジ色の斑点は、ソフトウェアがGFPの強度を測定する場所表す。ルールセットが処理された胚にGFPの発現の拡張された領域を見つけることができたことに注意してください。
Discussion
ゼブラフィッシュの化学物質の画面のスループットを制限する主な要因は、体系的にプロセスのイメージングと解析のための96ウェルプレートへの方法論の欠如です。多細胞生物の画像は、複雑な低コントラスト、そして自然の中で異質なので、既存の画像解析アルゴリズムは、生体内の特定の構造を検出し、定量化に失敗する。ほとんど公開されてゼブラフィッシュの化学物質の画面では、そのための手順全体に専用の担当者による個々のウェルの目視検査を含む。これは通常、数値リードアウトの生成と画面イメージとデータのアーカイブを完全に防ぐことができます。また、マニュアルの評価、すなわちイメージベースのスクリーニング、、スクリーンの性能のレトロスペクティブ分析を実施するためのスクリーニングキャンペーン（例えば、毒性または発達障害）の主な焦点ではなかった表現型の変化を調べ、交差する機能のいくつかの重要な利点を排除同じ化合物ライブラリーを使用して過去や未来の画面で参照スクリーニングデータ。
本報告書では、ユーザーの介入なしに、マルチウェルプレート内のゼブラフィッシュ胚の自動化されたイメージングと解析のための方法論を強調する。我々のイメージTG（dusp6：d2EGFP）に焦点リーダー（Molecular Devices社、カリフォルニア州サニーベール）のスキャンImageXpressウルトラレーザーで自動化された画像キャプチャ96ウェルプレートでPT6胚と定義するもの"認知ネットワーク技術定量化することGFPに基づいた画像解析アルゴリズムを開発トランスジェニック胚の頭部で発現。方法は、段階的応答を達成し、小分子FGFシグナル伝達の活性化因子のin vivo活性の定量化。同様の結果がそれは市販のプレートリーダー2の様々なゼブラフィッシュ胚の自動化された画像キャプチャを実現することが可能であることを文書化する落射蛍光ベースのArrayScan II（セロミクス社、ピッツバーグPA）が得られた。自動的に多細胞生物の画像を分析する方法論の開発は、人間の観察によって、視覚スコアリングの必要性を排除し、将来のスクリーン付きレトロスペクティブ分析と比較のための数値データと画像の生成とアーカイブを有効にする。
Acknowledgments
この作品は、ツァンにHukriede、NCI / NIH（P01 CA78039）フォークトに、とNHLBI / NIH（1R01HL088016）にNICHD / NIH（1R01HD053287）によって運営されている。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tricaine (MS222) | Sigma-Aldrich | Cat.# A-5040 |
References
- Molina, G. A., Watkins, S. C., Tsang, M. Generation of FGF reporter transgenic zebrafish and their utility in chemical screens. BMC Dev Biol. 7, 62-62 (2007).
- Vogt, A. Automated image-based phenotypic analysis in zebrafish embryos. Dev Dyn. 238, 656-663 (2009).
- Molina, G. Zebrafish chemical screening reveals an inhibitor of Dusp6 that expands cardiac cell lineages. Nat Chem Biol. 5, 680-687 (2009).
