Video Bioinformatica Analyse van menselijke embryonale stamcellen Colony Growth

Summary

Video bioinformatica is de geautomatiseerde verwerking, analyse, begrip, en data mining van biologische ruimte-tijd gegevens uit microscopische video's. Het doel van dit artikel is om aan te tonen een methode voor het meten van menselijke embryonale stamcellen kolonie groei van het gebruik van een video bioinformatica methode.

Abstract

Omdat de video-data zijn complex en bestaan ​​uit veel afbeeldingen, mijnbouw informatie van videomateriaal is moeilijk om te doen zonder de hulp van de computer software. Video bioinformatica is een krachtige kwantitatieve benadering voor de extractie van ruimte-tijd gegevens van video-beelden met behulp van computer software voor dating mining en analyse uit te voeren. In dit artikel introduceren we een video bioinformatica methode voor het kwantificeren van de groei van menselijke embryonale stamcellen (hESC) door het analyseren van time-lapse video's verzameld in een Nikon BioStation CT-incubator uitgerust met een camera voor video-imaging. In onze experimenten werden hESC kolonies die werden vastgemaakt aan Matrigel gefilmd voor 48 uur in de BioStation CT. Voor het bepalen van het tempo van de groei van deze kolonies werden recepten ontwikkeld met behulp van CL-Quant software die gebruikers in staat stelt te extraheren verschillende soorten van gegevens van videobeelden. Om nauwkeurig te evalueren kolonie groei werden drie recepten gecreëerd. De eerste gesegmenteerd het beeld in de kolonie en de achtergrond, de tweede verbeterde het beeld om kolonies nauwkeurig te definiëren in de video-sequentie, en de derde gemeten van het aantal pixels in de kolonie in de tijd. De drie recepten werden uitgevoerd in de juiste volgorde op de video-data verzameld in een BioStation CT om de snelheid van de groei van individuele hESC kolonies meer dan 48 uur te analyseren. Te controleren of de waarheid van de CL-Quant recepten, werden dezelfde gegevens handmatig geanalyseerd met behulp van Adobe Photoshop-software. Wanneer de gegevens verkregen met behulp van de CL-Quant recepten en Photoshop werden vergeleken waren de resultaten nagenoeg identiek zijn, met vermelding van de CL-Quant recepten eerlijk waren. De hier beschreven methode kan worden toegepast op alle video-gegevens groeipercentages van hESC of andere cellen die groeien in kolonies te meten. Daarnaast kunnen andere video bioinformatica recepten worden ontwikkeld in de toekomst voor andere cel processen, zoals migratie, apoptose, en celadhesie.

Protocol

Deel 1: Experimentele Procedure

Video gegevens bevatten een overvloed aan informatie. Echter, deze informatie is vaak moeilijk te halen en bij het handmatig gedaan door mensen en kan eisen vele uren van het personeel de tijd te voltooien. Handmatige analyse door mensen is ook onderhevig aan variatie in interpretatie en fout. Video bio-informatica is het gebruik van computer software om specifieke gegevens van videobeelden mijne. Deze methode van analyse is snel en kan elimineren fout die optreedt wanneer de analyse gebeurt met de hand door de mens. Het doel van dit artikel is om aan te tonen een methode voor het kwantificeren van menselijke embryonale stamcellen kolonie groei van het gebruik van een video bioinformatica methode.

In dit artikel werden time lapse video beelden verzameld met behulp van een Nikon BioStation CT incubatie-eenheid die het mogelijk maakt meerdere velden van de cellen af ​​te beelden na verloop van tijd (afb. 1). De methoden die in dit rapport beschreven zijn van toepassing op video data verzameld door een video-microscopische ingesteld.

In onze experimentele opzet, we verguld H9 hESC in 12-well kultuur platen gedurende 48 uur. Tijdens deze pauze werden de kolonies toegestaan ​​om volledig te bevestigen en op Matrigel verspreiden. Vervolgens werden de platen met aangebouwde hESC kolonies overgebracht naar het BioStation CT en gedurende een extra 48 uur. Terwijl in de BioStation, waren beelden van de kolonies verzameld op 7 minuten en werden later gebruikt om time-lapse video-sequenties te creëren. Video's voor elke kolonie werden vervolgens geanalyseerd om kolonie groei met behulp van video bioinformatica recepten ontwikkeld met de CL-Quant software te kwantificeren. De analyses gedaan met behulp van recepten die met de CL-Quant software werden gecontroleerd op eerlijkheid handmatig met behulp van Adobe Photoshop.

Deel 2: Bereiding van aangesloten hESC kolonies

1. Grow hESC op Matrigel gecoate 6-well platen, en een keer 70% confluentie bereikt is, replate een goed van de 6-wells plaat in 5 wells van een 12-well Matrigel gecoate plaat als volgt.
2. Aspireren medium uit een putje met hESC.
3. Spoel goed 2x met 1 ml PBS.
4. Voeg 1 ml Accutase en incubeer gedurende 1 minuut bij 37 ° C en 5% CO _2.
5. Voeg 10 tot 12 glazen kralen in de put en schud de plaat tot de koloniën helemaal los van de bodem van de put.
6. Neutraliseer Accutase gebruik van 1 ml van mTeSR medium of MEF geconditioneerd medium.
7. Centrifugeer de celsuspensie in een 15 ml conische buis bij 200g gedurende 3 minuten.
8. Giet het supernatant en de breuk pellet met 500μl vers mTeSR medium.
9. Plaat druppelsgewijs 100μl van de hESC suspensie in elk putje in een 12-well plaat.
10. Rock-plaat heen en weer voorzichtig en neem culturen onder een lichtmicroscoop. Zorg ervoor dat de cel klonten gelijkmatig verdeeld over de plaat.
11. Plaats de 12-wells plaat terug in de incubator.
12. Laat hESC te bevestigen en te groeien voor 48 uur (een kortere tijd kan worden gebruikt).
13. Na 48 uur, om decanteren het medium en was putten met 500ul van PBS te verwijderen ongebonden cellen.
14. Voeg 1 ml mTeSR medium aan elk putje.
15. Commentaar: onmiddellijk de plaat in de incubator / microscoop voor video-imaging.
16. Beginnen met het verzamelen time-lapse beelden. Probeer velden te selecteren met discrete enkele kolonies die niet waarschijnlijk om te groeien in andere kolonies.
17. Andere methoden voor het kweken en het opzetten van hESC kan worden gebruikt in plaats van de bovengenoemde protocol.

Deel 3: Video Bioinformatics

CL-Quant software werd gebruikt om drie 'recepten' die wanneer deze wordt uitgevoerd in de juiste volgorde zal het aantal pixels of het gebied in microns voor elke kolonie na verloop van tijd vast te stellen te creëren. De drie recepten zijn gebouwd in de juiste volgorde en voor deze toepassing onder meer segmentatie, toebehoren en meting.

Het analyseren van hESC kolonie groei met behulp van de CL-Quant software / recept ontwikkeling:

1. De segmentatie recept is eerst geschapen.
2. Scan de hele video om ervoor te zorgen dat de video bruikbaar is. Controleer of de gehele kolonie blijft in het gezichtsveld en dat andere koloniën komen niet in het veld.
3. Open de segmentatie wizard en klik op de knop "Volgende".
4. Selecteer het juiste afbeelding kanaal (dat wil zeggen, fase, groen, rood, enz.) en klik op de knop "Volgende".
5. Pick "soft matching" van de 3 keuzes en klik op "next".
6. Selecteer "willen" regio's door de regio's cirkelen op de afbeelding meestal de buitenste rand van de kolonie aan het centrale gebied van de kolonie.
   • Dit gebied moet zo klein mogelijk, maar moet representatief zijn voor de gehele kolonie.
   • Bij het gebruik van fase-contrast microscopie, moet u de halo rond de kolonie onder meer voor nauwkeurige kolonie selectie door de software.
   • Kies een of twee regio's van belang die kunnen tonen verschillendepixel patronen in de kolonie, maar niet kiezen te veel "wil", die kan leiden tot onjuiste masker toepassing.
7. Klik op de knop "Volgende".
8. Selecteer "niet willen" regio's door cirkelen gebieden op de afbeelding die geen deel uitmaken van de kolonie en geen deel uit van de achtergrond. Dit zijn regio's die patronen die je wenst te onderdrukken en onder meer pixels van de artefacten, zoals puin en dode cellen. Klik op "next".
9. Selecteer "achtergrond" door omcirkelen regio's die u wilt onderdrukken.
   • Het "niet willen" en "achtergrond" regio's verschillen in die achtergrond moet uniform en waarschijnlijk te zien zijn in elk frame.
   • Typisch selecteren we de grijze achtergrond rond de kolonie.
10. Klik op de knop "Volgende".
11. Een gekleurde masker moet worden weergegeven over uw regio van belang (figuur 2A).
12. Als het masker niet precies betrekking op de regio van belang, kan de segmentatie drempel bereik (bevindt zich aan de rechterbenedenhoek van de software display) worden verhoogd of verlaagd.
13. De segmentatie wizard vraagt ​​voor verdere masker gebied fine tuning indien nodig.
14. Wilt u uw masker te veranderen, kiest u 'Update soft matching regio's ". Hiermee kunt u de "wil", "niet willen", of "achtergrond" gebieden.
15. Als het masker bevredigend is, selecteer "toe te passen drempel en sla mijn masker ', en klik op de knop" Volgende ".
16. Het masker wordt dan weergegeven in een andere kleur.
17. Selecteer "finish".
18. Het recept moet worden weergegeven op de rechter bovenhoek van de software, en het moet de naam "segmentatie recept".
19. Wijzig de naam van het recept als u dat wilt door rechts te klikken en "rename".
20. Voor een controle ter plaatse, klik rechts en plaats de muis over "van toepassing recept".
21. Een menu zal aantonen dat kunt u het aantal frames dat u wilt selecteren wanneer een controle ter plaatse het recept te gebruiken. Voer het recept voor elke 10 frames om controle ter plaatse van de juistheid van masker plaatsing.
22. Als het masker pikt delen van kleine ongewenste regio's of puin, kunt u een "verbetering recept" voor het aanbrengen van het masker te verbeteren in de regio van belang.
23. Voor het maken van een verbetering recept, klik rechts op de "verbetering recept" map en klik vervolgens op "nieuw". Een nieuwe uitbreiding recept moet worden weergegeven.
24. Van de oorspronkelijke gezichtsveld (FOV), klik op de "schakelt verbetering module" knop aan de rechterkant van het beeld. Muis over de iconen in de werkbalk om de juiste te identificeren.
25. Selecteer "etikettering" dropdown menu.
26. Selecteer "etikettering 4 connected".
27. Selecteer "etikettering 4 connected2".
28. Een nieuwe taak balk moet worden weergegeven.
29. Pak de eerste masker (mask0) van de segmentatie recept en sleep het naar de "input" box.
30. De balk moet nu weer "invoermasker #".
31. Sleep het pictogram met het "invoermasker #" om het masker 0 icoon.
32. Zoek "min size" in de taakbalk en stel het aantal tot de enige regio van belang wordt weergegeven. Zorg ervoor dat u klikt op "uitvoeren" door elke fitting beproeving.
33. Als u tevreden bent met uw minimale grootte aangepast, klikt u op de "verbetering recept" die u eerder hebt gemaakt. (Fig. 2B)
34. Aan de onderkant van het scherm, selecteert u "opslaan op recept".
35. De software vraagt ​​nu om "geselecteerde recept overschrijven?", Selecteer "ja"
36. Controle ter plaatse van de uitbreiding recept volgens dezelfde procedures als hierboven voor een controle ter plaatse segmentatie.
37. Als tevreden met de segmentatie en de versterking recepten, kies 'creëren meting template' aan de rechterkant werkbalk.
38. De naam van de sjabloon als u dat wilt.
39. In de meting sjabloon venster, plaatst u de cursor boven clipart cel figuur. Houd de Ctrl-toets ingedrukt en selecteer de cel.
40. Haal het vinkje weg 'default parameter' en vink 'gebied parameter' onder 'morfologie'.
41. Exit 'template' venster.
42. Selecteert u het pictogram gemaakt in de meting recept.
43. De naam van het recept.
44. Ga naar en selecteer 'template' tab in de rechterbovenhoek.
45. Sleep uw eerder gemaakte meting template op de meting venster.
46. Klik op 'Ja' om door te gaan.
47. In de meting recept venster, selecteer 'Channel mappings', 'Whole cel' dan.
48. Selecteer 'Mask mappings'.
49. Dan 'Hele cel' selecteer optie voor een betere masker.
50. Selecteer de 'Measurement recept' onder de tab Recept in het hoofdvenster.
51. Kies de 'Save' icoon binnen de Measurement recept venster.
52. Sluit vervolgens het venster.
53. Nu, sluiten en opnieuw openen van de 'FOV'.
54. Klik met de rechtermuisknop de 'Recept' icoon, selecteer 'Lock recept list' en opeenvolgend lopen de recepten op uw video-data.

Deel 4: Controle recept nauwkeurigheid met behulp van de Photoshop-software

Met het oog op het recept gemaakt met (CL-Quant softw te validerenzijn), kan dezelfde gegevens handmatig worden geanalyseerd met Adobe Photoshop. Voor deze analyse werd elke 10e frame (elke 70 min tijdstip) geanalyseerd om kolonie grootte meten over 48 uur.

1. Open een frame van een kolonie afbeelding in Adobe Photoshop.
2. Klik op de Magic Wand Tool in de werkbalk.
3. Klik op het gebied rond de kolonie, zodat het hele veld is bedekt, behalve de kolonie regio.
4. Klik op 'Bewerken in Quick Mask Mode' in de werkbalk en klik op de kolonie, zodat de kolonie is geselecteerd.
5. Zorg ervoor dat de stippellijn rond de kolonie past precies rond de periferie van de kolonie en niet erin. Als de stippellijn is niet rond de periferie, de tolerantie waarde dienovereenkomstig te wijzigen in de bovenste werkbalk.
6. Ga naar de 'Window' pull down menu en klik op 'Histogram'.
7. Noteer de pixel waarde als cache = 1. Als cache is 2, klik op de '!' om te schakelen naar een cache, en noteer de pixelwaarde.
8. Herhaal de bovenstaande procedure voor elke 10e frame. Minder totaal frames kunnen worden gebruikt indien gewenst.
9. Gegevens verzameld met behulp van Photoshop en CL-Quant software kan vervolgens aan elkaar worden uitgezet. Als de CL-Quant recepten waarheidsgetrouw, moet de curven voor de Photoshop-en CL-Quant analyse zeer vergelijkbaar zijn (afb. 3-5).
10. Als de recepten ontwikkeld met CL-Quant waarheidsgetrouw, kunnen ze betrouwbare wijze kan worden toegepast op andere video-data.
11. De waarde in het gebruik van video bio-informatica in deze analyse is dat zodra de segmentatie, toebehoren en meting recepten zijn ontwikkeld en gevalideerd, zullen ze de analyse uit te voeren veel sneller en nauwkeuriger dan een mens met behulp van Photoshop.

Representatieve resultaten

Figuur 1: Film strip van een hESC kolonie met frames op verschillende momenten tijdens de 48 uur van de groei in een BioStation CT. Frames werden genomen op 7 minuten.

Figuur 2: (A) Afbeelding van een hESC met een masker op de kolonie door de segmentatie recept. Gebieden van puin en achtergrond zijn ook gemaskerd waaruit blijkt dat een verbetering recept is nodig om de nauwkeurigheid van de evaluatie te verbeteren. (B) Afbeelding van dezelfde kolonie, zoals in "A" na de uitbreiding is uitgevoerd. Het masker selecteert nu alleen de kolonie en het lawaai is geschrapt uit de selectie.

Figuur 3: Grafiek toename van de kolonie grootte (in pixels) meer dan 48 uur als bepaald met behulp van CL-Quant software en Photoshop. Deze grafiek plots de ruwe data en laat zien dat kolonies beginnen om verschillende maten. Het toont ook aan dat beide methoden van de meting zijn in goede overeenstemming.

Figuur 4: Grafiek dezelfde gegevens als in figuur 3 na normalisatie om het percentage stijging van de kolonie grootte van meer dan 48 uur laten zien. Hieruit blijkt dat de groeicijfers op elkaar lijken, ongeacht de grootte en de kolonie te beginnen dat beide maatregelen van de analyse geven vergelijkbare resultaten.

Figuur 5: Grafiek waarin de middelen voor de genormaliseerde gegevens in figuur 4. Deze grafiek toont duidelijk een goede overeenkomst tussen de analyses gedaan met behulp van video-bioinformatica (CL-Quant software) en Photoshop en constateert dat de recept waarheidsgetrouw is. De lichte daling in het gebied voor de Photoshop-gegevens op beeld 325 is te wijten aan een aantal video's niet worden opgenomen in de Photoshop-analyse.

Discussion

Video bioinformatica tools zijn krachtige voor het snel extraheren van gegevens uit videobeelden. Ons protocol voor het kwantificeren van hESC kolonie groei laat zien een toepassing van video bio-informatica om een ​​biologisch probleem. Deze methode is kwantitatief en heeft de interessante eigenschap van het openbaren van gegevens van individuele hESC kolonies. Video bioinformatica recepten kunnen worden ontwikkeld om andere cellulaire processen zoals proliferatie, migratie, apoptose, en cel gehechtheid aan de ondergrond, en cel gehechtheid aan aangrenzende cellen te controleren. De nauwkeurigheid van de recepten ontwikkeld met behulp van CL-Quant software werd gevalideerd met behulp van Photoshop en bleek te zijn waarheidsgetrouw. Zodra de juiste recepten worden ontwikkeld, kunnen videogegevens van elke bron zeer snel worden geanalyseerd. De tijd die nodig is om video-gegevens met behulp van video bioinformatica tools te analyseren is aanzienlijk minder dan de tijd die nodig is voor de analyse uitgevoerd door de hand met behulp van Photoshop. Bovendien is de analyse uitgevoerd door de computer is minder gevoelig voor fouten, omdat de computer analyseert de gegevens op dezelfde manier elke keer, terwijl een mens het uitvoeren van een analyse kan fouten maken of iets anders oordelen elke keer dat een beeld geanalyseerd. Hoewel niet besproken als onderdeel van dit protocol, kunnen video's ook worden onderzocht op morfologische veranderingen in de kolonie. Deze parameter zou nuttig zijn in gevallen waarin de behandeling groepen zijn opgenomen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
mTeSR1 Human Embryonic Stem Cell Maintenance Medium	Stem Cell Technologies	05850	or any suitable medium for hESC culture.
BD Matrigel	BD Biosciences	356234	or other suitable substrate.
DMEM/F12 Basal Medium	Invitrogen	11330-032
Phosphate Buffered Saline without Ca2+ and Mg2+
Accutase Enzyme Cell Detachment Medium	eBioscience	00-4555-56	or other suitable detachment enzyme.
3mm Glass beads	Fisher Scientific	11-312A	optional.
12-well Tissue Culture Plates	BD Biosciences	353043	or any other plate format.
Nikon BioStation CT/IM			or other incubator/microscope suitable for collecting video data.
CL-Quant software (Nikon) and/or Photoshop (Adobe).