Vidéo analyse bioinformatique des droits de croissance de la tige colonie de cellules embryonnaires

Summary

Vidéo bioinformatique est le traitement automatisé, l'analyse, la compréhension et l'exploration des données biologiques de la spatio-temporelle des données extraites de vidéos microscopiques. Le but de cet article est de démontrer une méthode pour mesurer la croissance embryonnaire humaine colonie de cellules souches en utilisant une méthode vidéo bioinformatique.

Abstract

Parce que les données vidéo sont complexes et sont constitués de nombreuses images, d'information minière du matériel vidéo est difficile à faire sans l'aide de logiciels informatiques. Vidéo bioinformatique est une approche puissante pour l'extraction quantitative spatio-temporelle des données à partir d'images vidéo en utilisant un logiciel informatique pour effectuer des mines datant et d'analyse. Dans cet article, nous introduisons une méthode vidéo bioinformatique pour quantifier la croissance des cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) en analysant les vidéos time-lapse recueillies dans un incubateur à Nikon BioStation CT équipé d'une caméra pour l'imagerie vidéo. Dans nos expériences, les colonies de CSEh qui étaient attachés à Matrigel ont été filmés pendant 48 heures dans le CT BioStation. Pour déterminer le taux de croissance de ces colonies, les recettes ont été développées en utilisant CL-Quant logiciel qui permet aux utilisateurs d'extraire divers types de données à partir d'images vidéo. Pour évaluer avec précision la croissance de colonies, trois recettes ont été créées. La première segmentation de l'image dans la colonie et le fond, le second rehaussé l'image pour définir les colonies tout au long de la séquence vidéo avec précision, et le troisième a mesuré le nombre de pixels dans la colonie au cours du temps. Les trois recettes ont été exécutées en séquence sur les données recueillies dans la vidéo un CT BioStation d'analyser le taux de croissance des colonies de CSEh individuelles de plus de 48 heures. Pour vérifier la véracité des recettes CL-Quant, les mêmes données ont été analysées manuellement en utilisant le logiciel Adobe Photoshop. Lorsque les données obtenues en utilisant les recettes CL-Quant et Photoshop ont été comparés, les résultats étaient pratiquement identiques, indiquant les recettes CL-Quant étaient véridiques. La méthode décrite ici pourrait être appliquée à toutes les données vidéo pour mesurer les taux de croissance de CSEh ou d'autres cellules qui se développent dans les colonies. En outre, d'autres vidéos de recettes bioinformatique peuvent être développés à l'avenir pour d'autres processus cellulaires tels que la migration, l'apoptose et adhésion cellulaire.

Protocol

Partie 1: Procédure expérimentale

Les données vidéo contiennent une abondance d'informations. Toutefois, cette information est souvent difficile d'extraire et quand fait manuellement par des humains et peuvent nécessiter de nombreuses heures de temps du personnel à remplir. L'analyse manuelle par l'homme est également soumis à des variations dans l'interprétation et l'erreur. Vidéo bioinformatique implique l'utilisation d'un logiciel informatique pour la mine de données spécifiques à partir d'images vidéo. Cette méthode d'analyse est rapide et permet d'éliminer l'erreur qui survient lorsque l'analyse se fait manuellement par des humains. Le but de cet article est de démontrer une méthode pour quantifier la croissance embryonnaire humaine colonie de cellules souches en utilisant une méthode vidéo bioinformatique.

Dans ce papier, des images vidéo en temps écoulé ont été recueillies en utilisant une unité Nikon BioStation d'incubation CT qui permet de multiples champs de cellules à imager au fil du temps (fig. 1). Les méthodes décrites dans ce rapport sont applicables aux données vidéo recueillies par n'importe quelle vidéo microscopiques mis en place.

Dans notre modèle expérimental, nous avons plaqué H9 de CSEh dans les plaques de 12 puits de culture tissulaire pendant 48 heures. Durant cet intervalle, les colonies étaient autorisées à fixer et totalement réparties sur Matrigel. Ensuite, les plaques avec des colonies de CSEh attachés ont été transférés au CT BioStation et incubées pendant 48 heures supplémentaires. Alors que dans le BioStation, les images des colonies ont été prélevés à intervalles de 7 minutes et ont ensuite été utilisés pour créer des séquences vidéo time-lapse. Vidéos pour chaque colonie ont ensuite été analysées afin de quantifier la croissance de colonies en utilisant la vidéo recettes bioinformatique développé avec le logiciel CL-Quant. Les analyses effectuées en utilisant des recettes créées avec le logiciel CL-Quant véracité a été vérifiée manuellement à l'aide d'Adobe Photoshop.

Partie 2: Préparation des colonies CSEh attachés

1. Cultivez CSEh sur Matrigel revêtement des plaques 6 puits, et une fois 70% de confluence est atteinte, replate un puits de la plaque de 6 puits dans 5 puits d'une de 12 puits plaque enduite de Matrigel comme suit.
2. Aspirer moyennes à partir d'un puits contenant des CSEh.
3. Rincez bien avec 2x 1ml de PBS.
4. Ajouter 1ml de Accutase et incuber pendant 1 minute à 37 ° C et 5% de CO _2.
5. Ajouter 10 à 12 perles de verre dans le puits et agiter la plaque doucement jusqu'à ce que les colonies détacher complètement du fond du puits.
6. Neutraliser Accutase utilisant 1ml de mTeSR moyen ou MEF milieu conditionné.
7. Centrifuger la suspension de cellules dans un tube 15ml conique à 200g pendant 3 minutes.
8. Décanter le surnageant et le culot de rompre avec 500μl de milieu mTeSR frais.
9. 100 ul chute de plaques sages de la suspension de CSEh dans chaque puits dans une plaque de 12 puits.
10. Plaque de rocher en arrière en douceur et d'observer les cultures sous un microscope optique. Assurez-vous que des amas cellulaires sont répartis uniformément sur la plaque.
11. Placez la plaque arrière de 12 puits dans l'incubateur.
12. Autoriser CSEh pour attacher et de grandir pendant 48 heures (une durée plus courte peut être utilisée).
13. Après 48 heures, décanter les puits de la moyenne et laver avec 500ul de PBS pour enlever les cellules seules.
14. Ajouter 1ml de milieu mTeSR à chaque puits.
15. Commentaire: Placez immédiatement la plaque dans l'incubateur / microscope pour l'imagerie vidéo.
16. Commencer à recueillir des time-lapse images. Essayer de choisir les champs avec discrets colonies isolées qui ne sont pas susceptibles de se transformer en d'autres colonies.
17. D'autres méthodes de culture et de la mise en place de CSEh peuvent être utilisées à la place du protocole ci-dessus.

Partie 3: Vidéo Bioinformatique

CL-Quant logiciel a été utilisé pour créer trois «recettes» qui lorsqu'il est exécuté en séquence va déterminer le nombre de pixels ou de la zone en microns pour chaque colonie au fil du temps. Les trois recettes sont construits dans l'ordre et pour cette application comprennent la segmentation, l'amélioration et de mesure.

Analyser la croissance de colonies de CSEh en utilisant le logiciel CL-Quant / développement recette:

1. La recette de segmentation est créé en premier.
2. Balayage toute la vidéo pour s'assurer que la vidéo est utilisable. Vérifiez que toute la colonie reste dans le champ de vision et que les autres colonies ne pas entrer sur le terrain.
3. Ouvrez l'assistant de segmentation et cliquez sur le bouton "suivant".
4. Sélectionnez le canal d'image correcte (à savoir, la phase, vert, rouge, etc) et cliquez sur le bouton "suivant".
5. Pick "correspondant douce» sur les 3 choix et cliquez sur "suivant".
6. Sélectionnez "veulent" les régions en encerclant les régions sur l'image typique du bord extérieur de la colonie à la zone centrale de la colonie.
   • Cette zone doit être aussi petit que possible, mais doit être représentatif de toute la colonie.
   • Lorsque vous utilisez la microscopie à contraste de phase, être sûr d'inclure le halo autour de la colonie pour la sélection de la colonie précise par le logiciel.
   • Choisissez une ou deux régions d'intérêt qui peuvent montrer différentesmotifs de pixels dans la colonie, mais ne prenez pas trop de «désirs» qui peut aboutir à l'application masque inexactes.
7. Cliquez sur le bouton "suivant".
8. Sélectionnez "ne veulent pas« régions en encerclant les régions sur l'image qui ne font pas partie de la colonie et ne fait pas partie de l'arrière-plan. Ce sont les régions qui ont des modèles que vous souhaitez supprimer et inclure des pixels d'artefacts tels que des débris et cellules mortes. Cliquez sur "Suivant".
9. Sélectionnez «de fond», en encerclant les régions que vous souhaitez supprimer.
   • Le "ne veulent pas" et "fond" des régions diffèrent dans ce contexte doit être uniforme et susceptibles d'apparaître dans chaque trame.
   • Typiquement, nous sélectionnons le fond gris autour de la colonie.
10. Cliquez sur le bouton "suivant".
11. Un masque de couleur doit être affiché sur votre région d'intérêt (figure 2A).
12. Si le masque ne couvre pas exactement la région d'intérêt, la plage de seuil de segmentation (situé dans le coin en bas à droite de l'écran du logiciel) peut être augmenté ou diminué.
13. L'assistant de segmentation invites pour le réglage masque de zone amende supplémentaire si nécessaire.
14. Si vous souhaitez modifier votre masque, sélectionnez "Mise à jour molle régions correspondantes". Cela vous permet de changer le «vouloir», «ne veulent pas», ou «de fond» domaines.
15. Si le masque est satisfaisante, sélectionnez "Appliquer seuil et sauver mon masque", et cliquez sur le bouton "suivant".
16. Le masque sera alors affiché dans une couleur différente.
17. Sélectionnez «Terminer».
18. La recette doit être affichée dans le coin supérieur droit du logiciel, et il devrait être appelé «recette de segmentation".
19. Renommer la recette si vous le souhaitez en cliquant droit et "renommer".
20. Pour vérifier tache, faites un clic droit et placez la souris sur «appliquer la recette".
21. Un menu apparaîtra qui vous permet de sélectionner le nombre d'images que vous souhaitez utiliser lors de la tache vérifier la recette. Exécuter la recette pour 10 cadres de repérer vérifier l'exactitude du placement de masque.
22. Si le masque reprend des pièces de petites régions ou des débris indésirables, vous pouvez créer une "recette amélioration» pour améliorer l'ajustement du masque pour la région d'intérêt.
23. Pour créer une recette de mise en valeur, clic droit sur ​​la «recette d'amélioration" du dossier, puis cliquez sur "Nouveau". Une recette nouvelle amélioration doit être affichée.
24. Dans le champ de vue original (FOV), cliquez sur le «renforcement basculer le module" situé à droite de l'image. Passez la souris sur les icônes dans la barre d'outils pour identifier la bonne.
25. Sélectionnez "étiquetage" du menu déroulant.
26. Sélectionnez "4 étiquetage connecté".
27. Sélectionnez "étiquetage 4 connected2".
28. Une nouvelle barre des tâches doit être affichée.
29. Prenez le masque initial (mask0) de la recette de segmentation et de le glisser dans la "saisie" boîte.
30. La barre devrait maintenant afficher "masque de saisie #".
31. Faites glisser l'icône avec le "masque de saisie #" pour l'icône du masque 0.
32. Trouvez "taille min" dans la barre de tâche et réglez le nombre jusqu'à ce que la région d'intérêt est affiché. Assurez-vous que vous cliquez sur "Exécuter" dans chaque essai de montage.
33. Une fois que vous êtes satisfait de votre ajustement de la taille minimale, cliquez sur la «recette d'amélioration» que vous avez créés précédemment. (Figure 2B)
34. Au bas de l'écran, sélectionnez "enregistrer la recette".
35. Le logiciel vous invite maintenant à "écraser recette sélectionnée?", Sélectionnez "oui"
36. Vérifiez de façon ponctuelle la recette d'amélioration en utilisant les mêmes procédures que ci-dessus pour la segmentation contrôle ponctuel.
37. S'il est satisfait de la segmentation et des recettes accessoires, sélectionnez "Créer un modèle de mesure» sur la barre de droite.
38. Renommez le modèle pour si vous le souhaitez.
39. Dans la fenêtre de modèle de mesure, de déplacer le curseur sur la figure de cellule cliparts. Maintenez la touche Ctrl enfoncée et sélectionnez la cellule.
40. Décochez «paramètre par défaut» et «paramètre de zone de« vérifier sous «morphologie».
41. «Modèle» Sortir fenêtre.
42. Sélectionnez l'icône créée dans la recette de mesure.
43. Renommer la recette.
44. Déplacer vers et sélectionnez onglet "Modèle" dans le coin supérieur droit.
45. Glissez-déposez votre modèle de mesure précédemment créé dans la fenêtre de mesure.
46. Cliquez sur 'Oui' pour continuer.
47. Dans la fenêtre de la recette de mesure, sélectionnez «Channel mappings», «cellule entière», alors.
48. Sélectionnez «Masque mappings».
49. Puis "cellule entière" sélectionnez l'option pour le masque amélioré.
50. Sélectionnez la "recette de mesure" dans l'onglet recette dans la fenêtre principale.
51. Sélectionnez 'Enregistrer' icône dans la fenêtre de la recette de mesure.
52. Ensuite, fermez la fenêtre.
53. Maintenant, fermez et rouvrez le «FOV».
54. Faites un clic droit la «recette» icône, «la liste de verrouillage recette" sélectionner et d'exécuter les recettes séquentiellement sur vos données vidéo.

Partie 4: Vérification de la précision recette utilisant le logiciel Photoshop

Afin de valider la recette créée avec (CL-Quant Softwsont), les mêmes données peuvent être analysées manuellement avec Adobe Photoshop. Pour cette analyse, chaque trame 10ème (chaque point de temps 70 min) a été analysée pour mesurer la taille des colonies de plus de 48 heures.

1. Ouvrez une trame d'une image colonie dans Adobe Photoshop.
2. Cliquez sur l'outil Baguette magique dans la barre d'outils.
3. Cliquez sur la zone autour de la colonie de sorte que le champ entier est couvert, sauf la région colonie.
4. Cliquez sur "Modifier en mode Masque dans la barre d'outils et cliquez sur la colonie de sorte que la colonie est sélectionnée.
5. Assurez-vous que la ligne pointillée autour de la colonie s'adapte parfaitement à la périphérie de la colonie et non à l'intérieur. Si la ligne pointillée n'est pas autour de la périphérie, modifiez la valeur de tolérance dans la barre d'outils supérieure en conséquence.
6. Allez à la "Fenêtre" du menu déroulant et cliquez sur "Histogramme".
7. Notez la valeur de pixel lorsque le cache = 1. Si le cache est de 2, cliquez sur le '!' de changer de mettre en cache une, puis notez la valeur du pixel.
8. Répétez le processus ci-dessus pour chaque trame 10e. Moins de cadres au total peuvent être utilisés si désiré.
9. Les données recueillies à l'aide de Photoshop et CL-Quant logiciel peut ensuite être tracée ensemble. Si les recettes CL-Quant êtes véridiques, les courbes pour l'analyse de Photoshop et CL-Quant devrait être très similaire (fig. 3-5).
10. Si les recettes élaborées avec CL-Quant êtes véridiques, ils peuvent être appliqués à des données de manière fiable vidéo.
11. La valeur en utilisant la vidéo bioinformatique dans cette analyse est qu'une fois que la segmentation, l'amélioration et la mesure des recettes sont élaborés et validés, ils effectuent l'analyse beaucoup plus rapidement et plus précisément d'un humain à l'aide de Photoshop.

Les résultats représentatifs

Figure 1: Bande de film d'une colonie de CSEh montrant des cadres à différents moments pendant 48 heures de croissance dans un CT BioStation. Cadres ont été prises à intervalles de 7 minutes.

Figure 2: (A) Image d'une CSEh avec un masque placé sur la colonie par la recette de la segmentation. Domaines de débris et de fond sont également masqués qui indique que la recette amélioration est nécessaire pour améliorer l'exactitude de l'évaluation. (B) Image de la même colonie, comme indiqué dans "A" après l'amélioration a été réalisée. Le masque sélectionne maintenant que la colonie et le bruit a été éliminée de la sélection.

Figure 3: Graphique montrant augmentation de taille des colonies (en pixels) en 48 heures tel que déterminé à l'aide CL-Quant logiciel et Photoshop. Ce graphique trace les données brutes et montre que les colonies commencent à différentes tailles. Il montre également que les deux méthodes de mesure sont en bon accord.

Figure 4: Graphique montrant les mêmes données que dans la figure 3 après normalisation pour montrer l'augmentation de taille de la colonie pour cent dans plus de 48 heures. Cela montre que les taux de croissance sont similaires quelle que soit la taille des colonies de départ et que les deux mesures de l'analyse donnent des résultats similaires.

Figure 5: Graphique montrant les moyens pour les données normalisées à la figure 4. Ce graphique montre clairement une bonne concordance entre les analyses effectuées en utilisant la vidéo bioinformatique (CL-Quant logiciels) et Photoshop et établit que la recette est véridique. Le léger ralentissement dans la zone pour les données de Photoshop à l'image 325 est due à plusieurs vidéos ne sont pas inclus dans l'analyse de Photoshop.

Discussion

Vidéo des outils bioinformatiques puissants pour les extraire des données rapidement à partir d'images vidéo. Notre protocole de quantification de la croissance de colonies de CSEh démontre une application de vidéo bioinformatique à un problème biologique. Cette méthode est quantitative et a la particularité intéressante de données révélant des colonies CSEh individuelles. Vidéo recettes bioinformatique peut être développé pour contrôler d'autres processus cellulaires comme la prolifération, la migration, l'apoptose et la fixation des cellules au substrat, et l'attachement des cellules aux cellules adjacentes. La précision de l'recettes élaborées à l'aide CL-Quant logiciel a été validée à l'aide de Photoshop et a été trouvé pour être véridique. Une fois les recettes appropriées sont développées, les données vidéo à partir de n'importe quelle source peut être analysé très vite. Le temps requis pour analyser les données vidéo en utilisant la vidéo outils bioinformatiques est nettement inférieur au temps nécessaire pour l'analyse effectuée par la main en utilisant Photoshop. Par ailleurs, l'analyse effectuée par l'ordinateur est moins sujette à l'erreur, que l'ordinateur va analyser les données de la même façon à chaque fois, tout un humain effectuant une analyse peut faire des erreurs ou des jugements un peu différent à chaque fois qu'une image est analysée. Bien qu'il n'ait pas discuté dans le cadre de ce protocole, les vidéos peuvent également être examinés pour des changements morphologiques dans la colonie. Ce paramètre est utile dans les cas où les groupes de traitement sont inclus.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
mTeSR1 Human Embryonic Stem Cell Maintenance Medium	Stem Cell Technologies	05850	or any suitable medium for hESC culture.
BD Matrigel	BD Biosciences	356234	or other suitable substrate.
DMEM/F12 Basal Medium	Invitrogen	11330-032
Phosphate Buffered Saline without Ca2+ and Mg2+
Accutase Enzyme Cell Detachment Medium	eBioscience	00-4555-56	or other suitable detachment enzyme.
3mm Glass beads	Fisher Scientific	11-312A	optional.
12-well Tissue Culture Plates	BD Biosciences	353043	or any other plate format.
Nikon BioStation CT/IM			or other incubator/microscope suitable for collecting video data.
CL-Quant software (Nikon) and/or Photoshop (Adobe).