Video Bioinformatik Analys av mänskliga embryonala stamceller Colony Tillväxt

Summary

Video bioinformatik är automatiserad bearbetning, analys, förståelse och datautvinning av biologiska tid och rum uppgifter som hämtas från mikroskopiska videor. Syftet med denna artikel är att demonstrera en metod för att mäta mänskliga embryonala stamceller tillväxt cell koloni med hjälp av en video bioinformatik metod.

Abstract

Eftersom videodata är komplexa och består av många bilder, gruv information från videomaterial är svårt att göra utan hjälp av datorprogram. Video bioinformatik är en kraftfull kvantitativ metod för att utvinna tid och rum data från video-bilder med hjälp av datorprogram för att utföra dejting gruv-och analys. I denna artikel presenterar vi en video bioinformatik metod för kvantifiering tillväxten av stamceller från mänskliga embryon (hESC) genom att analysera tidsförlopp filmer samlas i en Nikon BioStation CT inkubator utrustad med en kamera för avbildning. I våra experiment har hESC kolonier som var knutna till Matrigel filmade i 48 timmar i BioStation CT. För att bestämma tillväxten av dessa kolonier var recept utvecklats med hjälp av CL-Quant programvara som gör att användarna kan extrahera olika typer av data från videobilder. Att noggrant utvärdera koloni tillväxt har tre recept som skapats. Den första segmenterade bilden i kolonin och bakgrund, den andra förbättrade bilden för att definiera kolonier i hela videosekvensen korrekt, och den tredje mätte antalet pixlar i kolonin över tiden. De tre recept kördes i sekvens på video samlas in i en BioStation CT för att analysera tillväxten i enskilda hESC kolonier över 48 timmar. För att verifiera sanningshalten i CL-Quant recept har samma data analyseras manuellt med hjälp av Adobe Photoshop. När de uppgifter som erhållits med hjälp av CL-Quant recept och Photoshop jämfördes, var resultaten i stort sett identiska, med angivande av CL-Quant recept var sanningsenlig. Den här beskrivna metoden kan tillämpas på någon video data för att mäta tillväxt på hESC eller andra celler som växer i kolonier. Dessutom kan andra video bioinformatik recept ska utvecklas i framtiden för andra celler processer som migration, apoptos, och celladhesion.

Protocol

Del 1: Experimentell Förfarande

Videodata innehåller ett överflöd av information. Detta är dock informationen ofta svårt att extrahera och när det görs manuellt av människor och kan kräva många timmar av personalen tid att slutföra. Manuell analys av människor är också föremål för variation i tolkning och fel. Video bioinformatik innebär användning av mjukvara till min specifika data från videobilder. Denna analysmetod är snabb och kan eliminera fel som uppstår när analysen görs manuellt av människor. Syftet med denna artikel är att demonstrera en metod för kvantifiering av humana embryonala stamceller tillväxt cell koloni med hjälp av en video bioinformatik metod.

I detta papper har tid förfaller videobilder in med hjälp av en Nikon BioStation CT inkubation enhet som tillåter flera områden celler som skall avbildas över tiden (Fig. 1). De metoder som beskrivs i denna rapport är tillämpliga på video som samlas in av någon video mikroskopiska inrättas.

I vår experimentell design, pläterade vi H9 hESC i 12-brunnars plattor vävnadsodling i 48 timmar. Under detta intervall var kolonier får möjlighet att helt koppla och sprids på Matrigel. Då var tallrikar med bifogade hESC kolonier överfördes till BioStation CT och inkuberas i ytterligare 48 timmar. Även i BioStation var bilder av kolonierna samlats vid 7 minuters mellanrum och användes senare för att skapa tidsintervaller videosekvenser. Videor för varje koloni har sedan analyserats för att kvantifiera koloni tillväxt med hjälp av video bioinformatik recept utvecklat med CL-Quant programvara. Analyserna görs med recept skapas med CL-Quant mjukvara kontrollerades på sanningshalt manuellt med Adobe Photoshop.

Del 2: Förberedelse av bifogade hESC kolonier

1. Odla hESC på Matrigel bestruket 6-brunnars plattor, och när 70% confluency nås, replate en brunn på 6-brunnar i 5 brunnar i en 12-väl Matrigel plåt enligt följande.
2. Aspirera medium från en brunn som innehåller hESC.
3. Skölj väl 2x med 1 ml PBS.
4. Tillsätt 1 ml Accutase och inkubera i 1 minut vid 37 ° C och 5% CO _2.
5. Lägg till 10-12 glaspärlor i brunnen och skaka plåten försiktigt tills kolonier helt loss från botten av brunnen.
6. Neutralisera Accutase med 1 ml mTeSR medium eller MEF betingad medium.
7. Centrifugera cellsuspensionen i en 15ml koniskt rör i 200g i 3 minuter.
8. Dekantera supernatanten och bryta pellets med 500μl av färska mTeSR medium.
9. Tavla droppvis 100μl av hESC suspensionen i varje brunn i en 12-brunnar.
10. Rock platta fram och tillbaka försiktigt och iaktta kulturer under ett ljusmikroskop. Se till att cellen klumpar jämnt fördelade över hela plattan.
11. Placera 12-brunnar tillbaka in i inkubatorn.
12. Låt hESC att fästa och växa till 48 timmar (kortare tid kan användas).
13. Efter 48 timmar, för att dekantera mediet och tvätta brunnar med 500ul PBS bort lösa celler.
14. Tillsätt 1 ml mTeSR medium till varje brunn.
15. Kommentar: Placera omedelbart plattan i inkubatorn / mikroskop för video avbildning.
16. Börja samla in time-lapse bilder. Försök att välja fält med diskreta enstaka kolonier som sannolikt inte kommer att växa till andra kolonier.
17. Andra metoder för odling och inrätta hESC kan användas i stället för nämnda protokollet.

Del 3: Video Bioinformatik

CL-Quant program användes för att skapa tre "recept" som när det körs i sekvens kommer att avgöra antal pixlar eller område i mikron för varje koloni över tiden. De tre recept byggs i sekvens och för denna ansökan omfatta segmentering, tillbehör och mätning.

Analysera tillväxt hESC koloni med CL-Quant program / recept utveckling:

1. Segmenteringen receptet skapas först.
2. Skanna hela videon för att se till att videon är användbar. Kontrollera att hela kolonin kvar i synfältet och att andra kolonier inte kommer in på planen.
3. Öppna segmentering guiden och klickar på knappen "nästa".
4. Välj rätt bild kanal (dvs. fas, grön, röd, etc) och klicka på knappen "nästa".
5. Välj "mjuka matchning" av de 3 val och klicka på "nästa".
6. Välj "vill ha" regioner genom att ringa in områden på bilden typiskt den yttre kanten av kolonin till den centrala delen av kolonin.
   • Detta område bör vara så liten som möjligt men bör vara representativa för hela kolonin.
   • Vid användning av mikroskopi faskontrast, se till att inkludera halo runt kolonin för exakt koloni urval av programvaran.
   • Välj en eller två regioner av intresse som kan visa olikapixel mönster inom kolonin, men plocka inte alltför många "vill" som kan resultera i felaktiga mask ansökan.
7. Klicka på knappen "nästa".
8. Välj "vill inte" regioner genom att ringa in områden på bilden som inte är del av kolonin och inte en del av bakgrunden. Detta är regioner som har mönster du vill undertrycka och inkluderar pixlar av artefakter såsom skräp och döda celler. Klicka på "Nästa".
9. Välj "bakgrund" genom att ringa in områden som du vill undertrycka.
   • De "vill inte" och "bakgrund" regioner skiljer sig i detta sammanhang bör vara enhetlig och sannolikt kommer att dyka upp i varje bildruta.
   • Vanligtvis väljer vi den grå bakgrunden kring kolonin.
10. Klicka på knappen "nästa".
11. En färgad mask som ska visas på din region av intresse (Fig. 2A).
12. Om masken inte exakt täcker regionen av intresse, kan segmenteringen tröskeln intervallet (längst ner i högra hörnet av programvaran displayen) ökas eller minskas.
13. Segmenteringen guiden frågar efter ytterligare mask området finjusteringar om det behövs.
14. Om du vill ändra din mask, välj "uppdatera mjuka matchning regioner". Detta låter dig ändra "vill ha", "vill inte", eller "bakgrund" områden.
15. Om masken är tillfredsställande, välj "tillämpa gränsvärden och spara min mask" och klicka på knappen "nästa".
16. Masken kommer sedan att visas i en annan färg.
17. Välj "Slutför".
18. Receptet ska visas på den högra övre hörnet av programvaran, och det bör kallas "segmentering recept".
19. Byt namn på receptet om du vill genom att högerklicka och "byta namn".
20. För kontroller på plats, högerklicka och placera musen över "gäller recept".
21. En meny kommer att visa att du kan välja antalet bildrutor du vill använda när kontroller på plats receptet. Kör recept för varje 10 ramar till platsen kontrollera riktigheten i masken placering.
22. Om masken plockar upp delar av små oönskade regioner eller skräp kan du skapa en "förbättring recept" för att förbättra montering av masken till regionen av intresse.
23. För att skapa en förbättring recept, högerklicka på "förbättring recept" mapp och klicka sedan på "nya". En ny förbättring recept ska visas.
24. Från den ursprungliga synfältet (FOV), klicka på "växlar förbättring modulen" knappen till höger om bilden. Musen över ikonen i verktygsfältet för att identifiera den rätta.
25. Välj "märkning" rullgardinsmenyn.
26. Välj "märkning 4 connected".
27. Välj "märkning 4 connected2".
28. En ny Aktivitetsfältet ska visas.
29. Ta första mask (mask0) från segmenteringen receptet och dra den till "input" rutan.
30. Baren bör nu visa "indatamasken #".
31. Dra ikonen med "indatamasken #" för att masken 0 ikonen.
32. Hitta "min storlek" i aktivitetsfältet och justera numret tills enda regionen av intresse visas. Se till att du klickar på "köra" igenom varje montering rättegång.
33. När du är nöjd med minsta justering, klicka på "förbättring recept" du har skapat tidigare. (Fig. 2B)
34. Längst ner på skärmen, välj "spara till recept".
35. Programmet frågar nu att "skriva över valda receptet?", Välj "ja"
36. Kontroll på plats att höja receptet med samma förfarande som ovan för kontroller på plats segmentering.
37. Om nöjd med segmentering och recept tillbehör väljer du "Skapa mätning mall" på höger verktygsfält.
38. Byt namn på mallen om du vill.
39. I mätningen mallen fönstret, flytta markören över clipart cell figur. Håll Ctrl-tangenten och markera cellen.
40. Avmarkera "default parametern" och markera "område parametern" under "morfologi".
41. Exit "mall" fönster.
42. Välj ikonen som skapats i mätningen receptet.
43. Byt namn på receptet.
44. Flytta till och välj "mall" fliken i övre högra hörnet.
45. Dra och släpp dina tidigare skapat mätning mall på mätningen fönstret.
46. Klicka på 'Ja' för att fortsätta.
47. I mätningen receptet fönstret "mappningar Kanal" välj sedan "Whole cell".
48. Välj "Mask avbildningar".
49. Välj sedan "helcells alternativet för bättre mask.
50. Välj "Measurement recept" enligt receptet fliken i huvudfönstret.
51. Välj "Spara" ikon inom mätning receptet fönstret.
52. Stäng sedan fönstret.
53. Nu, stänga och öppna den "FOV.
54. Högerklicka på "recept", välj "Lås recept lista" och köra recept sekventiellt på din videodata.

Del 4: Kontroll recept precision med hjälp av Photoshop

För att validera recept skapas med (CL-Quant prog.uppdär), kan samma data analyseras manuellt med Adobe Photoshop. För denna analys var var 10: e bildruta (varje 70 min tidpunkt) analyseras för att mäta koloni storlek över 48 timmar.

1. Öppna en ram av en koloni bild i Adobe Photoshop.
2. Klicka på Magic Wand Tool i verktygsfältet.
3. Klicka på området runt kolonin så att hela området är täckt utom kolonin regionen.
4. Klicka på "Redigera i Snabbmaskläge" i verktygsfältet och klicka på kolonin så kolonin är vald.
5. Se den prickade linjen runt kolonin passar precis runt i utkanten av kolonin och inte inuti. Om den streckade linjen är inte runt periferin, ändra toleransen värdet i det övre verktygsfältet därefter.
6. Gå till "Window" pull down menyn och klicka på "Histogram".
7. Skriv ner pixelvärdet när cache = 1. Om cacheminnet är 2, klicka på '! " att byta till cache 1, och anteckna pixelvärde.
8. Upprepa ovanstående process för var 10: e ram. Färre totala ramar kan användas om så önskas.
9. Uppgifter som samlats in med hjälp av Photoshop och CL-Quant programvara kan sedan ritas tillsammans. Om CL-Quant recept är sanningsenliga, bör kurvorna för Photoshop och CL-Quant analys vara mycket lika (se diagram 3-5).
10. Om recepten utvecklats med CL-Quant är sanningsenliga, de kan säkert tillämpas på andra videodata.
11. Värdet i att använda video bioinformatik i denna analys är att när segmentering, tillbehör och recept mätning utvecklats och validerats, kommer de att utföra analysen mycket snabbare och mer korrekt än en människa med hjälp av Photoshop.

Representativa resultat

Figur 1: Film band med en hESC koloni som visar bilder på olika tider under 48 timmar av tillväxt i en BioStation CT. Ramar togs vid 7 minuters intervall.

Figur 2: (A) Bild av ett hESC med en mask placeras på kolonin av segmentering recept. Områden av skräp och bakgrund är också maskerade tyder på att en förbättring recept behövs för att förbättra noggrannheten i utvärderingen. (B) Bild av samma koloni som visas i "A" efter att förbättring har genomförts. Masken väljer nu bara kolonin och buller har eliminerats från urvalet.

Figur 3: Diagram som visar ökningen av kolonin storlek (i pixlar) över 48 timmar som bestäms med hjälp CL-Quant programvara och Photoshop. Detta diagram plottar rådata och visar att kolonier startar på olika storlekar. Det visar också att både mätmetoder är bra överenskommelse.

Figur 4: Diagram som visar samma data som i Figur 3 efter normalisering för att visa procentig ökning i kolonin storlek under 48 timmar. Detta visar att tillväxttakten är likartade oavsett start koloni storlek och att båda åtgärderna av analys ger liknande resultat.

Figur 5: Diagram som visar medel för normaliserade data i Figur 4. Detta diagram visar tydligt god överensstämmelse mellan de analyser som görs med hjälp av video bioinformatik (CL-Quant mjukvara) och Photoshop och konstaterar att receptet är sanningsenliga. Den lilla nedgången i område för Photoshop-data i ram 325 beror på flera videor att inte vara med i Photoshop analysen.

Discussion

Video bioinformatiska verktyg är kraftfulla för att snabbt extrahera data från videobilder. Vårt protokoll för att kvantifiera tillväxt hESC kolonin visar en tillämpning av video bioinformatik ett biologiskt problem. Denna metod är kvantitativ och har intressanta inslag i att avslöja uppgifter från enskilda hESC kolonier. Video bioinformatik recept kan utvecklas för att övervaka andra cellulära processer såsom proliferation, migration, apoptos och cellbindning till underlaget, och cellbindning till angränsande celler. Noggrannheten av recepten utvecklats med CL-Quant programvara har validerats med hjälp av Photoshop och befanns vara sanningsenlig. När lämpliga recept utvecklas, kan videodata från valfri källa analyseras mycket snabbt. Den tid som krävs för att analysera video data med hjälp av video bioinformatiska verktyg är betydligt mindre än den tid som behövs för analys utförs för hand med hjälp av Photoshop. Dessutom är den analys som gjordes av datorn mindre risk för fel, eftersom datorn kommer att analysera data på samma sätt varje gång, medan en människa att utföra en analys kan göra fel eller något annorlunda bedömningar varje gång en bild analyseras. Även om det inte behandlas som en del av detta protokoll kan filmer också undersökas för morfologiska förändringar i kolonin. Denna parameter skulle vara användbart i fall där behandlingen grupper ingår.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
mTeSR1 Human Embryonic Stem Cell Maintenance Medium	Stem Cell Technologies	05850	or any suitable medium for hESC culture.
BD Matrigel	BD Biosciences	356234	or other suitable substrate.
DMEM/F12 Basal Medium	Invitrogen	11330-032
Phosphate Buffered Saline without Ca2+ and Mg2+
Accutase Enzyme Cell Detachment Medium	eBioscience	00-4555-56	or other suitable detachment enzyme.
3mm Glass beads	Fisher Scientific	11-312A	optional.
12-well Tissue Culture Plates	BD Biosciences	353043	or any other plate format.
Nikon BioStation CT/IM			or other incubator/microscope suitable for collecting video data.
CL-Quant software (Nikon) and/or Photoshop (Adobe).