利用γH2AX形成作为分子标志物来定量DNA双链断裂，已成为辐射生物学中不可或缺的工具。本文展示了使用免疫荧光法对细胞经辐射暴露后γH2AX焦点进行定量分析的方法。
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摘要
摘要
DNA双链断裂（DSBs）由内源性代谢过程或外源性因素引起，是与细胞存活和基因组完整性维持密切相关的一类最为严重的DNA损伤。DSBs发生后早期反应之一是在高度保守的C末端SQEY基序中的丝氨酸-139位点对组蛋白变体H2AX进行磷酸化，从而形成γH2AX。1. 在DNA双链断裂（DSBs）发生后，H2AX会迅速被磷脂酰肌醇3-激酶（PIKK）家族蛋白——即共济失调毛细血管扩张症突变蛋白（ATM）、DNA-蛋白激酶催化亚基以及ATM和RAD3相关蛋白（ATR）——所磷酸化。2通常只有少数几个碱基对（bp）参与双链断裂（DSB），但由于染色质修饰在DNA损伤信号传导和修复中的重要作用，信号会被显著放大。主要由ATM介导的H2AX磷酸化会扩散到邻近的染色质区域，每个DSB可影响约0.03%的细胞总H2AX。2,3. 这相当于在 DSB 位点周围约 2 Mbp 的染色质区域中，大约 2000 个 H2AX 分子发生磷酸化，从而形成离散的 γH2AX 焦点，可通过免疫荧光显微镜轻松观察和定量。2DSB处γH2AX的消失反映了损伤修复，然而关于DSB完全修复的定义仍存在争议；有观点认为DNA双链的重新连接已足以代表修复完成，但也有研究提出，染色质压缩状态的原始结构恢复是必要的。4-8. γH2AX 的消失至少部分涉及蛋白磷酸酶 2A 和蛋白磷酸酶 4C 介导的去磷酸化作用5,6. 此外，通过涉及H2A.Z与组蛋白交换的重新分布机制去除γH2AX也已被证实7,8. 重要的是，对γH2AX焦点的定量分析已在医学和核科学研究中得到广泛应用。在此，我们展示了最常用的免疫荧光方法，用于通过检测和定量γ射线照射后贴壁的人类角质形成细胞中的γH2AX焦点，以评估初始DNA损伤9.
方案
细胞制备
- 人角质形成细胞（FEP-1811）在添加了表皮生长因子、牛垂体提取物和 20 μg/ml 庆大霉素的无血清角质形成细胞培养基（K-SFM；Invitrogen）中培养，培养条件为 37°C 和 5% CO2。
- 使用胰蛋白酶-EDTA（0.05% v/v）消化获得单细胞悬液。
- 将细胞以每孔 10,000 个细胞的密度接种于 8 孔 Lab Tek II 培养腔载玻片中，并在 37°C 和 5% CO2 条件下孵育 3 天。
辐照
- 使用 137Cs 源（Gammacell 1000 Elite 照射装置；Nordion International, ON, Canada；20.6 秒/Gy）在冰上对细胞进行 2 Gy 剂量的照射
- 未照射的对照组细胞和接受 2 Gy 照射的细胞在 37°C、5% CO2 条件下孵育 1 小时。
免疫荧光染色
- 将培养基弃去，每孔加入 300 μL 磷酸盐缓冲液（PBS，不含 Ca2+ 或 Mg2+）洗涤细胞，并在旋转混合仪上孵育 5 分钟。
- 弃去缓冲液，每孔加入 100 μL 新鲜配制的 4%（v/v）多聚甲醛，将载玻片在室温下孵育 10 分钟。
所有孵育步骤均在加湿的染色槽中进行 - 随后用 PBS（不含 Ca2+ 或 Mg2+）洗涤细胞。将载玻片放入 Coplin 染色缸中，在旋转混合仪上孵育 5 分钟。此洗涤步骤重复进行两次。
- 弃去缓冲液，并用吸水纸轻轻吸除多余的 PBS。
- 每孔加入 100 μL 0.1%（v/v）Triton X-100 进行细胞通透处理，在室温下孵育 10 分钟。
- 按照上述第 3 和第 4 步所述方法，用 PBS（不含 Ca2+ 或 Mg2+）洗涤细胞。
- 每孔加入 100 μL BSA（1% v/v）封闭非特异性蛋白结合位点，在室温下孵育 20 分钟。
- 弃去多余的 BSA，每孔加入 100 μL 小鼠单克隆抗磷酸化组蛋白-H2AX 一抗（用 1% BSA 按 1:500 稀释；Millipore），在室温下孵育 1 小时。
- 按照上述第 3 和第 4 步所述方法，用 PBS（不含 Ca2+ 或 Mg2+）洗涤细胞，然后每孔加入 100 μL 二抗（Alexa Fluor 488 标记的山羊抗小鼠 IgG，用 1% BSA 按 1:500 稀释；Invitrogen），在避光条件下室温孵育 45 分钟。（稀释后的抗体在整个操作过程中均需避光保存）
- 按照上述第 10 步所述方法，用 PBS（不含 Ca2+ 或 Mg2+）洗涤细胞。操作过程中使用铝箔尽量减少光照。
- 每孔加入 100 μL TOPRO-3（按 1:500 稀释；Invitrogen）进行细胞核复染，在室温下孵育 10 分钟。
- 按照上述第 10 步所述方法，用 PBS（不含 Ca2+ 或 Mg2+）洗涤细胞。
- 小心从载玻片上移除腔室，吸除多余液体，让载玻片自然风干。
- 每孔滴加一滴 ProLong GOLD 抗荧光淬灭封片剂（Invitrogen），加盖盖玻片（22×50 mm）封片，并吸除载玻片边缘多余的液体。
- 将载玻片在室温下避光放置 30 分钟后，用指甲油密封。
- 分析前将载玻片在 4°C 避光条件下过夜保存。
显微镜 / 分析
- 使用 Zeiss LSM510 Meta 共聚焦显微镜，通过标准 GFP 激光（用于 γH2AX - Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠 IgG）和远红激光（用于 TOPRO-3）采集图像。通常使用 63 倍油镜物镜。
以 0.5 μm 的步长进行 Z 轴序列成像。选择 0.5 μm 的步长以最大程度减少存在于细胞核不同焦平面的焦点丢失。在分析过程中，对各个焦平面图像进行去卷积并叠加，生成最大投影图像，以减少焦点重叠（应用 Top-hat 滤波器）。 - 使用 Metamorph（Molecular Devices，美国）分析焦点数量。
该程序在设定阈值以排除背景后，对每个细胞中的焦点数量进行定量。相关数据记录于 Microsoft Excel 电子表格中，用于进一步分析。
图1. 未处理的人角质形成细胞及经2 Gy辐射后在37°C、5% CO2条件下继续培养1小时的细胞中γH2AX焦点（绿色）的免疫荧光可视化图像。DNA用TOPRO-3（蓝色）染色。图像使用Zeiss LSM 510 Meta共聚焦显微镜采集。标尺 = 10 μm。
图2. 人角质形成细胞经2 Gy辐照并在37°C、5% CO2条件下继续孵育1小时后，γH2AX焦点（绿色）的免疫荧光可视化图像。使用蔡司LSM 510 Meta共聚焦显微镜以0.5 μm Z轴层厚（1-9）采集图像，以确保获取所有焦点信号。随后使用Metamorph软件对图像进行叠加以进行定量分析。DNA用TOPRO-3（蓝色）染色。叠加后的γH2AX图像与蓝色通道图像合并以供观察。比例尺 = 10 μm。
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讨论
暴露于电离辐射（γ射线）后，γH2AX 焦点迅速形成，并在30-60分钟内达到峰值2。因此，我们选择照射后1小时的时间点以反映初始DNA双链断裂（DSB）的形成。本实验采用了临床上相关的2 Gy辐射剂量。然而，该方法可用于检测最高达4 Gy辐射剂量下的初始DSB形成；更高剂量下焦点出现显著重叠，导致无法准确量化。对于更长的照射后孵育时间，可使用更高的辐射剂量，因为随着DNA修复的进行，γH2AX焦点会逐渐消失，从而获得可量化的焦点数量。通常，照射后4小时至24小时的孵育时间被用于监测DNA修复过程。由于共聚焦显微镜激发激光的限制，我们采用了DNA染料TOPRO-3。更常用的核复染试剂是4,6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐（DAPI）。尽管我们使用了共聚焦显微镜，但具备z轴层扫功能的落射荧光显微镜也足以满足检测需求。该免疫荧光方法适用于其他贴壁生长的癌细胞和正常细胞系；我们已测试过T98G人胶质母细胞瘤细胞、正常人血管内皮细胞以及大鼠H9c2胚胎心室肌细胞。
最后，γH2AX的定量在电离辐射诱导的DNA损伤研究中具有重要价值，可用于监测DNA损伤（如本实验所示...
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致谢
感谢澳大利亚核科学与工程研究所的支持。TCK 获得了 AINSE 奖项资助。表观基因组医学实验室由澳大利亚国家健康与医学研究委员会（566559）资助。LM 获得了墨尔本研究奖学金（墨尔本大学）和生物医学影像合作研究中心补充奖学金的支持。莫纳什显微成像中心（Stephen Cody 博士和 Iśka Carmichael 博士）为本研究提供了 invaluable 的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 | |
|---|---|---|---|---|
| 角质形成细胞无血清培养基（K-SFM） | 培养基 | Invitrogen | 17005042 | 添加了人重组表皮生长因子1-53（EGF 1-53）和牛垂体提取物（BPE）的角质形成细胞培养基。 |
| Lab Tek II 培养腔载玻片（8孔） | 培养腔载玻片 | Nalge Nunc International | NUN154534 | |
| 盖玻片（22×50 mm） | 盖玻片 | Menzel-Glaser | CS2250100 | |
| 牛血清白蛋白（BSA） | Sigma-Aldrich | A7906 | 使用1% BSA封闭非特异性抗体结合位点。一抗和二抗均用1% BSA稀释。 | |
| PBS（不含Ca2+和Mg2+） | Invitrogen | 17-517Q | ||
| 0.5% 胰蛋白酶-EDTA ×10 | Invitrogen | 15400-054 | 使用0.05%胰蛋白酶-EDTA将细胞从培养瓶中消化下来。 | |
| 曲拉通X-100 | 试剂 | Sigma-Aldrich | T8787 | 使用0.1%曲拉通X-100对细胞进行透化处理。 |
| 多聚甲醛 | 试剂 | Sigma-Aldrich | 158127 | 使用4%多聚甲醛固定细胞。 |
| 小鼠单克隆抗磷酸化组蛋白H2AX抗体 | 一抗 | EMD Millipore | 16193 | 一抗稀释比例为1:500，溶于1% BSA中。 |
| Alexa Fluor 488标记的山羊抗小鼠IgG（H+L） | 二抗 | Invitrogen | 11029 | 二抗稀释比例为1:500，溶于1% BSA中。 |
| TOPRO3 | DNA染料 | Invitrogen | T3605 | 常用的DNA染料：4,6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐（DAPI）。仅可用于配备合适激发激光的显微镜。 |
| ProLong Gold | 抗荧光淬灭封片剂 | Invitrogen | P36930 | 在20°C时折射率为1.42。 |
| 组织培养瓶，带透气盖 | 培养瓶 | BD Biosciences | 353112 | |
| 组织培养皿（150×25 mm） | 培养皿 | BD Biosciences | 353025 | |
| 玻璃染色缸（Coplin Jar） | Grale Scientific P/L | 1771-OG | ||
| 染色槽 | Grale Scientific P/L | V1991.99 | ||
| Gammacell 1000 Elite 放射源 | γ射线辐照仪 | Nordion International Inc. | ||
| Zeiss LSM 510 Meta 共聚焦显微镜 | 共聚焦显微镜 | |||
| Metamorph | 图像分析软件 | Molecular Devices |
参考文献
- Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo. J. Cell Biol. 146, 905-916 (1999).
- Bonner, W. M. Gamma H2AX and cancer. Nature Reviews Cancer. 8 (12), 957-967 (2008).
- Savic, V. Formation of Dynamic [gamma]-H2AX Domains along Broken DNA Strands Is Distinctly Regulated by ATM and MDC1 and Dependent upon H2AX Densities in Chromatin. Molecular Cell. 34 (3), 298-310 (2009).
- Downs, J. Binding of chromatin-modifying activities to phosphorylated histone H2A at DNA damage sites. Mol Cell. 16 (6), 979-990 (2004).
- Chowdhury, D. [gamma]-H2AX Dephosphorylation by Protein Phosphatase 2A Facilitates DNA Double-Strand Break Repair. Molecular Cell. 20 (5), 801-809 (2005).
- Nakada, S., Chen, G., Gingras, A., Durocher, D. PP4 is a gamma H2AX phosphatase required for recovery from the DNA damage checkpoint. EMBO Rep. 9 (10), 1019-1026 (2008).
- Altaf, M., Auger, A., Covic, M., Côté, J. Connection between histone H2A variants and chromatin remodeling complexes. Biochem Cell Biol. 87 (1), 35-50 (2009).
- Kusch, T. Acetylation by Tip60 Is Required for Selective Histone Variant Exchange at DNA Lesions. Science. 306, 2084-2087 (2004).
- Hurlin, P. Progression of human papillomavirus type 18-immortalized human keratinocytes to a malignant phenotype. Proc Natl Acad Sci U S A. 88 (2), 570-574 (1991).
- Dickey, J. H2AX: functional roles and potential applications. Chromosoma. , Forthcoming (2009).
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