Summary
DNA双链分子标记γH2AX形成条纹的量化已成为辐射生物学中的一个非常宝贵的工具。在这里，我们表现出免疫荧光法检测细胞对辐射的暴露后γH2AX灶的定量使用。
Abstract
DNA双链断裂（DSB的），这是无论是内源性代谢过程或外源性诱导，是最关键的DNA损伤一个方面的生存和保持基因组完整性。早期反应的双链断裂感应是组蛋白H2A变体，H2AX的磷酸化，丝氨酸139残留，在高度保守的C -末端SQEY图案，形成γH2AX
Protocol
细胞制备
- 生长在角质形成细胞无血清培养人角质形成细胞（FEP - 1811）（K - SFM; Invitrogen公司）与表皮生长因子，牛垂体提取物和20微克/毫升庆大霉素的补充，在37 ° C和5％的CO 2 。
- 用胰酶- EDTA（0.05％V / V）分离制备单细胞悬液
- 细胞接种于8实验室TEK第二microchamber幻灯片（万细胞/孔）和幻灯片，在37 ° C和5％的CO 2孵育3天。
放射
- 冰使用的137 Cs源（1000 Gammacell精英辐照; Nordion公司国际上，加拿大; 20.6秒/ GY）与2戈瑞辐照细胞
- 未经辐照的控制和2 Gy照射细胞孵育1小时37 ° C和5％的CO 2 。
免疫荧光染色
- 媒体通风报信，洗涤细胞，每孔300μL的PBS（W / O CA 2 +或Mg 2 +的 ），并在5分钟的轨道混频器的旋转。
- 缓冲区是通风报信，新鲜配制的4％多聚甲醛（V / V），每孔加入幻灯片在室温下孵育10分钟100μL。
所有孵化加湿染色槽 - 细胞，然后用PBS（W / O型的Ca 2 +，Mg 2 +的 ）。 5分钟的轨道混频器，幻灯片被放置在一个Coplin JAR和旋转。此清洗步骤再重复两次。
- 缓冲区是通风报信，多余的PBS轻轻涂抹。
- 使用100毫升TRITON X - 100（0.1％V / V），每口井，在室温下孵育10分钟的细胞透。
- 细胞，用PBS冲洗（W / O型的Ca 2 +或Mg 2 +的 ）如在上述步骤3和4中所述
- 在室温下（1％V / V）与BSA的100毫升的非特异性蛋白结合，阻止每口井和20分钟的孵育。
- 多余的BSA是通风报信，鼠抗磷酸化组蛋白H2AX的抗体（1:500稀释，在1％BSA; Millipore公司）100μL，在室温下孵育1小时，每口井。
- 细胞用PBS冲洗（W / O型的Ca 2 +或Mg 2 +）的步骤3和第4段中所述和培养100μL二次抗体（的Alexa Fluor 488山羊抗鼠IgG稀释1:500，在1％BSA ; Invitrogen公司），每45分钟，在室温下在黑暗中。 （摊薄抗体，整个过程被蒙在鼓里）
- 细胞，用PBS冲洗（W / O型的Ca 2 +或Mg 2 +的 ）如在上述步骤3和4中所述然而，暴露在光线下是最小化使用铝箔。
- 核counterstaining是用100ml TOPRO3（稀释1:500; Invitrogen公司）进行，每口井，在室温下孵育10分钟的
- 细胞用PBS（W / O型的Ca 2 +或Mg 2 +）在第10步以上所述。
- 该商会进行了仔细从幻灯片中删除多余的水分，涂抹和幻灯片被允许空气干燥。
- 延长金防褪色的解决方案（Invitrogen）的下降，每孔加入幻灯片安装（22x50毫米盖玻片）和幻灯片的边缘周围的任何多余的液体被抹杀。
- 被关在黑暗为进一步在室温下30分钟，然后用指甲油密封幻灯片。
- 幻灯片一夜之间被储存在4 ° C的分析前的黑暗。
显微镜/分析
- 蔡司LSM510 META共焦Microscpe用来获取图像，使用标准的绿色荧光蛋白（γH2AX - 的Alexa Fluor 488山羊抗鼠IgG）和远红光激光器（TOPRO - 3）。通常，一个63 ×油浸物镜使用。
一个0.5微米的一步大小，图像采集在Z系列模式。一个0.5微米的一步大小选择不同的平面，以尽量减少损失灶目前在细胞核。在分析过程中，个别飞机卷积和堆放产生一个最大投射影像的疫源地，以尽量减少重叠（顶帽子过滤器适用于）。 - Metamorph分子器件，（美国）是用来分析疫源地的数量。
该计划定量灶，在每个单元的阈值后，已被应用到排除的背景。该信息被记录在Microsoft Excel电子表格，作进一步的分析。
图1。γH2AX灶（绿色）的免疫可视化未经处理的人角质形成细胞和细胞在2 Gy的照射，并为进一步的1小时在37℃，5％的CO 2。 DNA染色TOPRO - 3（蓝色）。使用的Zeiss LSM 510 META激光共聚焦显微镜获得的图像。酒吧= 10微米。
图2。γH2AX灶（绿色）的免疫可视化在人类角质形成细胞和细胞在2 Gy的照射，并为进一步的1小时在37℃，5％的CO 2。图片被收购使用的Zeiss LSM 510元共聚焦显微镜使用0.5微米的Z -切片（1-9），以确保所有灶被收购。的图像，然后堆放定量使用Metamorph。 DNA染色TOPRO - 3（蓝色）。堆叠堆叠γH2AX和蓝色的图像可视化。酒吧= 10微米。
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Discussion
暴露于电离辐射（γ射线），γH2AX灶形式迅速和疫源地号码后达到最大，在30-60 分钟之间2。因此，1小时后照射时间点反映初始DSB的形成。我们的实验中，我们已经用2 Gy的临床相关的辐射剂量。然而，该方法可用于辐射剂量高达4戈瑞检测初始DSB的形成;灶明显的重叠排除在较高剂量准确定量。可用于更高的辐射剂量辐照后的潜伏期较长时间，γH2AX灶因维修，造成量化的数字。通常情况下，4小时和24小时照射后孵育时间用于监测DNA修复。我们使用的DNA染色TOPRO - 3由于在我们的激光共聚焦显微镜激发激光器的限制。更常见的是，4,6 - diamidino - 2 - 苯基吲哚盐酸盐（DAPI）是用于核counterstaining。虽然我们使用共聚焦显微镜，ž与啶显微镜切片的能力是足够的。免疫荧光法适用于其他附着的癌细胞与正常细胞株，我们已经测试T98G人脑胶质瘤和正常的人类内皮细胞和大鼠H9C2胚胎心肌细胞。
最后，γH2AX定量在电离辐射诱导的DNA损伤，我们的实验和维修（放射敏感性）的DNA损伤监测所示的情况下是有用的。本试剂盒也可用于评估辐射（即辐射保护和增敏剂）调节细胞反应的化合物的疗效。此外，γH2AX是新兴作为一个潜在的衰老和疾病的分子标记，主要是在癌症 10 。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
澳大利亚核科学与工程学院的支持，是公认的事实。 TCK的是AINSE奖项的收件人。表观医学实验室是支持由国家卫生和澳大利亚的医学研究理事会（566559）。 LM是由墨尔本研究所（墨尔本大学）和生物医学成像的华润补充奖学金支持。莫纳什显微成像（DRS斯蒂芬科迪ISKA卡迈克尔）的支持是这项工作的宝贵。
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Keratinocyte-Serum Free Medium (K-SFM) | Media | Invitrogen | 17005042 | Keratinocyte media supplemented with human recombinant Epidermal Growth Factor 1-53 (EGF 1-53), and Bovine Pituitary Extract (BPE). |
| Lab Tek lI Chamber Slides (8-well) | Chamber Slides | Nalge Nunc international | NUN154534 | |
| Coverslips (22x50mm) | Coverslips | Menzel-Glaser | CS2250100 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | BSA (1%) is used to block any non-specific antibody binding. Primary and secondary antibodies are diluted in BSA. | |
| PBS (without Ca2+ and Mg2+) | Invitrogen | 17-517Q | ||
| 0.5% Trypsin-EDTA x10 | Invitrogen | 15400-054 | Trypsin-EDTA (0.05%) used to detach cells from culture flasks. | |
| Triton X-100 | Reagent | Sigma-Aldrich | T8787 | Triton X-100 (0.1%) used to permeabilise cells. |
| Paraformaldehyde | Reagent | Sigma-Aldrich | 158127 | Paraformaldehyde (4%) used to fix cells. |
| Mouse monoclonal anti-phospho histone-H2AX antibody | Primary Antibody | EMD Millipore | 16193 | Dilution of primary antibody (1:500), in 1% BSA. |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) | Secondary Antibody | Invitrogen | 11029 | Dilution of secondary antibody (1:500), in 1% BSA. |
| TOPRO3 | DNA Stain | Invitrogen | T3605 | DNA stain commonly used: 4,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI). Can only be used with microscopes with the appropriate excitation laser. |
| ProLong Gold | Anti-fade solution | Invitrogen | P36930 | Refractive index of 1.42 at 20°C. |
| Tissue Culture Flask, Vented Cap | Culture Flask | BD Biosciences | 353112 | |
| Tissue Culture Dish (150x25mm) | Petridish | BD Biosciences | 353025 | |
| Coplin Jar, glass | Grale Scientific P/L | 1771-OG | ||
| Staining Trough | Grale Scientific P/L | V1991.99 | ||
| Gammacell 1000 Elite Irradiator | Gamma Irradiator | Nordion International Inc. | ||
| Zeiss LSM 510 Meta Confocal | Confocal Microscope | |||
| Metamorph | Software for Imaging analysis | Molecular Devices |
References
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