Blastocysts से माउस ट्रोफोब्लास्ट स्टेम सेल की व्युत्पत्ति

Summary

इस वीडियो में, हम माउस blastocysts के अलगाव और ट्रोफोब्लास्ट blastocysts से स्टेम कोशिकाओं की व्युत्पत्ति को प्रदर्शित करता है. हम भी स्टेम सेल संपत्ति के रखरखाव के रूप में के रूप में अच्छी तरह से संस्कृति में भेदभाव की प्रेरण के लिए शर्तों का वर्णन.

Abstract

Trophectoderm की विशिष्टता स्तनधारी विकास की जल्द से जल्द भेदभाव की घटनाओं में से एक है. ट्रोफोब्लास्ट trophectoderm mediates आरोपण से व्युत्पन्न और वंश नाल के भ्रूण भाग उत्पन्न करता है. एक परिणाम के रूप में, इस वंश के विकास के भ्रूण के अस्तित्व के लिए आवश्यक है. माउस blastocysts से ट्रोफोब्लास्ट स्टेम कोशिकाओं (टीएस) की व्युत्पत्ति पहले तनाका द्वारा वर्णित किया गया था

Protocol

इस प्रोटोकॉल में, हम माउस blastocysts और टीएस सेल लाइनों की स्थापना की तैयारी का वर्णन. जनरल माउस जोड़तोड़ blastocysts के संग्रह, प्राकृतिक सहवास के लिए सेट अप और सुपर ovulation के प्रेरण सहित, पहले मूल रूप से मानक प्रोटोकॉल का पालन नेगी एट अल द्वारा सचित्र 2003 (pp146-150). .

व्युत्पत्ति और टीएस कोशिकाओं के रखरखाव

1. सेटअप ब्याज की चूहों के बीच प्रजनन पार.
2. फीडर कोशिकाओं के रूप में माउस भ्रूणीय fibroblasts (MEFs) तैयार करें. Blastocysts के संग्रह से पहले दो दिन, MEFs (2 ^{एक्स 6} कोशिकाओं 10) 100 मिमी बर्तन में चढ़ाया जाता है . अगले दिन, इन कोशिकाओं टीएस माध्यम के 10 मिलीलीटर mitomycin सी (20 मिलीग्राम / एमएल) एक 2 घंटे के ऊष्मायन के लिए 37 _में 2 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ युक्त के साथ व्यवहार कर रहे हैं. यह कोशिकाओं पीबीएस के साथ दो बार धोने के द्वारा पीछा किया जाता है. mitomycin सी इलाज कोशिकाओं को फिर से 12 अच्छी तरह प्लेटें ⁽¹ x 10 5 / अच्छी तरह से कोशिकाओं) में वरीयता प्राप्त कर रहे हैं.
3. ब्लास्टोसिस्ट संग्रह (3.5 डीपीसी, एक दिन के रूप में निर्दिष्ट) के दिन, MEF संस्कृति के माध्यम टीएस मध्यम प्लस 1x FGF4/Heparin (0.5 मिलीलीटर अच्छी तरह /) द्वारा प्रतिस्थापित किया गया है.
4. गर्भाशय के संग्रह के लिए तैयार: माउस euthanize और गर्भाशय (चित्रा 1 ए) का पता लगाने.
5. यह गर्भाशय ग्रीवा (मूत्राशय के पीछे स्थित) में संदंश के साथ लोभी द्वारा गर्भाशय निकालें और गर्भाशय और गर्भाशय ग्रीवा (चित्रा 1 बी) के जंक्शन में कटौती. गर्भाशय खींचो, झिल्ली और वसा ऊतकों को दूर ट्रिम कर दीजिए और oviduct (चित्रा 1C) के साथ जंक्शन नीचे गर्भाशय में कटौती. टीएस माध्यम से एक छोटा सा (0.2 मिलीलीटर) में 60 मिमी प्लेट मात्रा में ग्रीवा (चित्रा 1D) रखें.
6. टीएस एक 26 गेज सुई के साथ एक 1-मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग माध्यम से 1 मिलीलीटर के साथ प्रत्येक गर्भाशय सींग फ्लश. गर्भाशय के आधार में सुई डालें और धीरे धीरे एक नई 60 मिमी प्लेट में 1 मिलीलीटर टीएस मध्यम के साथ फ्लश. गर्भाशय और फुलाया किया जाना चाहिए निस्तब्धता के दौरान पूरी तरह से बढ़ा है.
7. लीजिए और blastocysts एक साफ 12 अच्छी तरह टीएस मध्यम युक्त थाली मुँह नियंत्रित विंदुक का उपयोग में सावधानी हस्तांतरण. Blastocysts टीएस माध्यम से 12 अच्छी तरह प्लेटें में सीरियल हस्तांतरण द्वारा तीन बार धोएं. प्लेस एक अच्छी तरह से प्रति ब्लास्टोसिस्ट (2A चित्रा) में एक 12 अच्छी तरह से 37 में mitomycin सी इलाज MEF भक्षण और संस्कृति युक्त थाली में ° सी, _5% सीओ 2 .
8. blastocysts zona pellucida से पक्षियों के बच्चे और 24 से 36 घंटे में कुओं के लिए देते हैं जाएगा. एक छोटा सा परिणाम आसानी से 3 दिन पर मनाया जाएगा. 500 μl ताजा टीएस मध्यम प्लस 1x FGF4/Heparin के साथ संस्कृतियों का फ़ीड.
9. 4 या 5 दिन, ब्लास्टोसिस्ट परिणाम disaggregation उसके आकार पर निर्भर करता है के लिए तैयार होना चाहिए. टीएस सेल disaggregation के लिए आदर्श आकार चित्रा 3B में सचित्र है. 0.5 मिलीलीटर पीबीएस के साथ संस्कृतियों को एक बार धो. 37 से कम 5 मिनट ° सी, 5% सीओ ₂ के लिए 100 मिलीलीटर 0.25% trypsin / EDTA और सेते जोड़ें . छोटे clumps में ऊपर और नीचे pipetting एक P100 pipetteman के साथ सख्ती से परिणाम तोड़ो. कुएं में टीएस-70cm - 1.5F4H (30% टीएस मध्यम, 70% MEF मुख्यमंत्री प्लस 1.5x FGF4/Heparin) जोड़कर trypsinization बंद करो. Disaggregation के बाद मध्यम 8 घंटे बदलें और हर 2 दिनों की कोशिकाओं को फ़ीड करने के लिए जारी है.
10. 6 और 10 (उच्च चर) दिनों के बीच टीएस सेल कालोनियों मनाया जा सकता है है. वे एक स्पष्ट कॉलोनी सीमा (चित्रा 2C) के साथ आकारिकी फ्लैट, उपकला शीट की तरह है. हर 2 दिनों संस्कृतियों फ़ीड करने के लिए जारी रखें
11. जब टीएस कोशिकाओं को 50% confluency (आमतौर पर 15 दिन और 20 के बीच) तक पहुँचने, Pbs के साथ एक बार धोने और 100 मिलीलीटर 0.25% trypsin / EDTA जोड़ें. पिपेट trypsinization के दौरान ऊपर और नीचे एक के पास एकल कक्ष निलंबन को सुनिश्चित करने. नई 6 अच्छी तरह से या 60mm mitomycin सी इलाज MEF भक्षण (2.5 x 10 ⁵ cells/6-well या 5 x10 ⁵ cells/60mm प्लेट) युक्त प्लेटें टीएस-70cm 1.5F4H हस्तांतरण और जोड़कर trypsinization बंद करो.
12. पारित होने के बाद मध्यम 8 घंटे बदलें और संस्कृतियों 2 दिन फ़ीड हर जारी है.
13. MEF भक्षण पर एक या दो और मार्ग (अंश के बीच 3-5 दिन) के बाद, टीएस कोशिकाओं उनके बिना सभ्य हो सकता है. क्योंकि MEFs संस्कृति की थाली trypsinization बाद टीएस कोशिकाओं की तुलना में बहुत तेजी से देते हैं, पक्षपाती दर में इस तरह के अंतर MEF भक्षण से टीएस कोशिकाओं को अलग करने के लिए उपयोग किया जा सकता है. संवर्धित कोशिकाओं को पारित करने के बाद, 30 मिनट के लिए 37 °% 5 _सी, सीओ 2 में उन्हें सेते . हाल MEFs थाली करने के लिए देते हैं और टीएस जनसंख्या निलंबन में रहता है. एक नई प्लेट को सतह पर तैरनेवाला स्थानांतरण. एक शुद्ध टीएस जनसंख्या प्राप्त करने के कई मार्ग के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएँ.
14. टीएस-70cm - 1.5F4H में टीएस कोशिकाओं को बनाए रखने और उनके पास हर 4 दिन (1:10 से 1:20 विभाजित) या जब संस्कृति 70% confluency तक पहुँचता है. उच्च (01:05 विभाजित से अधिक) घनत्व या उन्हें संवर्धन जब पीढ़ी मिला हुआ उनके भेदभाव का कारण हो सकता है के साथ कोशिकाओं की पासिंग.
15. टीएस कोशिकाओं की पहचान एक सेल मार्कर, Cdx2 (चित्रा 3) के immunostaining द्वारा पुष्टि की जा सकती है.

बर्फ़ीली टीएस कोशिकाओं

1. ठंड मध्यम (50% FBS, 30% टीएस मध्यम और 20% DMSO) 2x तैयार.
2. सहllect trypsinization द्वारा टीएस कोशिकाओं, 450g में 6 मिनट के लिए centrifugation द्वारा पीछा किया. उन्हें टीएस माध्यम 2x ठंड माध्यम के बराबर मात्रा के साथ Resuspend.
3. धीरे -70 पर एक isopropyl शराब कक्ष का उपयोग कोशिकाओं रुक डिग्री सेल्सियस और 24-48 घंटे के बाद तरल नाइट्रोजन के लिए स्थानांतरण.
4. एक 60 मिमी प्लेट (70 मिला हुआ%) आम तौर पर 2 शीशियों में रखा है.

टीएस कोशिकाओं विगलन

1. जल्दी 37 में शीशी पिघलना ° सी, उन्हें 10 मिलीलीटर टीएस मीडिया में (450g, 6 मिनट) centrifugation द्वारा इकट्ठा, और 30% टीएस मीडिया, 70cm 1.5F4H में resuspend.
2. कक्षों की एक शीशी में 60 मिमी प्लेट वरीयता प्राप्त है.

टीएस TGC में सेल भेदभाव

ट्रोफोब्लास्ट विशाल कोशिकाओं (TGCs) में टीएस कोशिकाओं की भेदभाव की वापसी MEF - मुख्यमंत्री, FGF4 और हेपरिन से प्रेरित किया जा सकता है. TGC phenotype (बड़े नाभिक) प्रेरण के चार दिन बाद पता लगाया जा सकता है (तनाका एट अल, 1998 और Chiu एट अल 2008. ). P450scc के Immunostaining विभेदित संस्कृति में इस TGC मार्कर (चित्रा -4 ए) की अभिव्यक्ति का पता लगाने. फ्लो PI के cytometric विश्लेषण (propidium आयोडाइड) दाग कोशिकाओं आगे विभेदित कोशिकाओं की उच्च डीएनए सामग्री (4B चित्रा) युक्त उपस्थिति से पता चलता है. इन परिणामों का सुझाव है कि टीएस कोशिकाओं endoreduplication गुजरना polyploid TGCs बनने.

प्रतिनिधि परिणाम

चित्रा 1 माउस ग्रीवा के विच्छेदन. (ए) ग्रीवा के स्थान तीर द्वारा संकेत दिया है. (बी) गर्भाशय और गर्भाशय ग्रीवा के जंक्शन भर में कट के रूप में दिखाया. (सी) (OV) अंडाशय के नीचे oviduct (ओवर ड्राफ्ट) के ठीक नीचे गर्भाशय कट. (डी) ग्रीवा की छवि.

चित्रा 2 प्रतिनिधि चित्रों माउस ब्लास्टोसिस्ट, ब्लास्टोसिस्ट परिणाम और ट्रोफोब्लास्ट कॉलोनी वर्णन. (ए) एक माउस E3.5 पर एकत्र ब्लास्टोसिस्ट दिखाया गया है. ICM, भीतर कोशिका द्रव्यमान, मीट्रिक टन, भित्ति trophectoderm, पीटी, ध्रुवीय trophectoderm. (बी) MEF भक्षण पर एक ट्रोफोब्लास्ट परिणाम दिखाया गया है. टीएस, ट्रोफोब्लास्ट स्टेम सेल. (सी) एक ट्रोफोब्लास्ट स्टेम सेल कॉलोनी MEF भक्षण पर एक स्पष्ट बढ़त दिखाता है. तीर सेल सीमा से संकेत मिलता है.

चित्रा 3 टीएस कोशिकाओं के विश्लेषण immunostaining पहचान. टीएस (ई.) और ES कोशिकाओं (नियंत्रण, एह) मार्कर की पहचान करने के लिए अधीन हैं. कक्ष एंटीबॉडी के साथ immunostained Oct4 (ए, ई) या Cdx2 (बी, एफ) पहचान कर रहे हैं, और (सी, जी) DAPI मर्ज किए गए चित्र में प्रस्तुत (डी, एच) द्वारा counterstained. स्केल बार, 50 सुक्ष्ममापी.

चित्रा 4 इन विट्रो में टीएस कोशिकाओं के भेदभाव. P450scc (हरा), (ए) (Undiff) undifferentiated या विभेदित कोशिकाओं (फर्क) संस्कृति में एक TGC मार्कर की अभिव्यक्ति के लिए जांच की गई, DAPI (लाल) के साथ counterstained. (बी) फ्लो विभेदित कोशिकाओं, पीआई के साथ दाग cytometric विश्लेषण, डीएनए सामग्री (M2, चार से अधिक प्रतियां M1, दो से चार प्रतियां) उपाय. M2 जनसंख्या polyploid ट्रोफोब्लास्ट कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करता है.

Discussion

इस वीडियो में, हम प्रक्रिया ग्रीवा और प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं से E3.5 blastocysts इकट्ठा करने के लिए टीएस सेल लाइनों की स्थापना प्रदर्शित करता है. हम भी टीएस कोशिकाओं के stemness बनाए रखने और विभेदित कोशिकाओं में भेदभाव प्रेरित हालत का वर्णन है. दो महत्वपूर्ण कदम को शुद्ध टीएस सेल लाइनों प्राप्त परिणाम disaggregation के लिए समय (9 कदम) कर रहे हैं और पहले बीतने (11 कदम) प्रसंस्करण. यह बताया गया है कि आदिम endoderm व्युत्पन्न कोशिकाओं संस्कृति में उठता के बाद व्यापक ब्लास्टोसिस्ट 11 कदम (Kunath एट अल., 2005) में 9 कदम या टीएस कालोनियों के अतिवृद्धि (> confluency 50%) में तबदील हो जाना कर सकते हैं. हालांकि आदिम endoderm व्युत्पन्न कोशिकाओं को एक गोल सेल आकार और टीएस कोशिकाओं की तुलना में कम संपर्क सेल सेल के साथ अपने विशिष्ट आकारिकी द्वारा पहचाना जा सकता है है, यह मुश्किल है कि उन्हें संस्कृति से दूर क्योंकि वे टीएस मध्यम में अच्छी तरह से विकसित और नहीं MEF भक्षण या FGF4 की आवश्यकता के लिए लग रहे हैं.

विभेदित TGCs लगातार टीएस संस्कृति में MEF - मुख्यमंत्री और FGF4 की उपस्थिति में भी पैदा हो सकता है. यदि एक शुद्ध टीएस आबादी वांछित है, इन विभेदित कोशिकाओं अंतर पक्षपाती दरों के आधार पर अलग किया जा सकता है. MEFs करने के लिए इसी प्रकार, TGCs संस्कृति प्लेटों टीएस कोशिकाओं की तुलना में तेजी से देते हैं, एक संभव प्रक्रिया के लिए एक शुद्ध टीएस जनसंख्या के रूप में 13 कदम में वर्णित प्राप्त प्रदान. वैकल्पिक रूप से, क्योंकि TGCs अत्यधिक पक्षपाती और अधिक trypsinization के लिए प्रतिरोधी रहे हैं, एक शुद्ध टीएस आबादी भी जल्दी trypisinization (3 मिनट), निलंबित टीएस कोशिकाओं के संग्रह से बाद से प्राप्त किया जा सकता है.

Materials

Reagents

TS medium: RPMI-1640, 20% FBS, 1 mM sodium pyruvate, 100 mM beta-mercapt–thanol and 100 mg/ml penicillin-streptomycin.

Mitomycin C: Dissolve 2 mg mitomycin C (Sigma M-0503) in 2 ml PBS and add this 2 ml mixture into 200 ml TS medium (10 ng/ml). Make 20 aliquots (10 ml) and store at -20°C until use. Add one aliquot per 100 mm plate.

Mouse embryonic fibroblast-condition medium (MEF-CM): Plate MEFs in 100 mm plates (1 x 106/plate). Next day, add 10 ml TS medium per dish and continue to culture for 48 hours. Collect the culture medium, filter them (0.45 mm) and store at -20°C in 35 ml aliquots. Thaw each aliquot when needed which can be stored at 4°C. The MEFs can be used to prepare for two more batches of CM before they become confluent.

PBS/BSA: Dissolve BSA, fraction V (Sigma A3311, 0.1% (w/v)) in PBS (10 ml), filter through a 0.45 mm syringe filter and make 1 ml aliquots in 1.5 ml tubes. Store at -70°C and thaw one tube when needed to prepare FGF4.

FGF4 (1000x): Resuspend lyophilized FGF4 (Sigma F8424, 25 mg) with 1 ml of the PBS/BSA solution. Mix well and make 10 aliquots (100 ml) into 1.5 ml tubes and store at -70°C. Thaw each tube when needed and store the remaining at 4°C, do not re-freeze. Dilute 1000 times in TS medium to obtain 1x FGF4 (25 ng/ml).

Heparin (1000x): Resuspend heparin (Sigma H3149, 10,000 units) in PBS to a final concentration of 1 mg/ml (1000x). Make 100 ml aliquots into 1.5 ml tubes and store at -70°C. Thaw aliquots when needed and store the remaining at 4°C, do not re-freeze. Dilute 1000 time in TS medium to obtain 1x heparin (1 ng/ml).