Härledning av Stem Mus trofoblasten Celler från Blastocyster

Summary

I denna video visar vi isolering av musen blastocyster och härledning av celler trofoblasten härrör från blastocyster. Vi beskriver också förutsättningarna för underhåll av stamceller egendom samt framkallande av differentiering i kultur.

Abstract

Specifikation av trophectoderm är en av de tidigaste differentiering händelserna i däggdjurens utveckling. Den trofoblasten härstamning kommer från trophectoderm förmedlar implantation och genererar fostrets del av moderkakan. Som ett resultat är utvecklingen av denna släkt viktigt för embryots överlevnad. Härledning av trofoblasten stamceller (TS) celler från mus blastocyster beskrevs först av Tanaka

Protocol

I detta protokoll beskriver vi beredning av musen blastocyster och upprättandet av TS cellinjer. Allmänna mus manipulationer före samlingen av blastocyster, inklusive de som inrättats för naturlig parning och framkallande av super ägglossning, följer i huvudsak standardprotokollet illustreras av Nagy et al. 2003 (pp146-150).

Härledning och underhåll av TS celler

1. Setup avel korsning mellan möss av intresse.
2. Förbered mus embryonala fibroblaster (MEFs) som feeder celler. Två dagar före insamlingen av blastocyster, (2 x 10 ⁶ celler) MEFs är pläterade i 100 mm rätter. Nästa dag är dessa celler som behandlats med 10 ml TS ett medium som innehåller mitomycin C (20 mg / ml) för en 2 timmars-inkubation vid 37 ° C, 5% CO _2. Detta följs av att tvätta cellerna två gånger med PBS. Den mitomycin C behandlade cellerna då seedade i 12-brunnars plattor (1 x 10 ⁵ celler / brunn).
3. På dagen av blastocysten samlingen (3,5 DPC, kallas dag ett), är MEF odlingsmedium ersättas med TS medelstora plus 1x FGF4/Heparin (0,5 ml / brunn).
4. Förberedelser för insamling av livmodern: euthanize musen och leta reda på livmodern (Figur 1A).
5. Ta bort livmodern genom att greppa den med tång i livmoderhalsen (sitter bakom urinblåsan) och spänner över korsningen av livmodern och livmoderhalsen (Figur 1B). Dra i livmodern, trim membranet och fettvävnad bort och skär livmodern under korsningen med äggledare (Figur 1C). Placera livmoder (figur 1D) i en liten volym (0,2 ml) av TS medium i en 60 mm plåt.
6. Skölj varje livmodern horn med 1 ml av TS mediet med en 1-ml spruta med en 26-nål. Stick in nålen i botten av livmodern och spola långsamt in i en ny 60 mm plåt med 1 ml TS medium. Livmodern ska pumpas och utökas helt vid spolning.
7. Samla och överföra blastocyster försiktigt i en ren 12 brunnar innehåller TS mediet med en mun-kontrollerad pipett. Tvätta blastocyster tre gånger av seriell överföring via TS medium i 12-brunnars plattor. Placera en blastocysten per brunn (Figur 2A) i en 12-brunnar innehåller mitomycin C-behandlade MEF matare och kultur vid 37 ° C, 5% CO _2.
8. Den blastocyster kläcks från zona pellucida och fäster brunnarna i 24 till 36 timmar. En liten utväxt kommer att vara lätt observeras på dag 3. Mata kulturer med 500 l färska TS medelstora plus 1x FGF4/Heparin.
9. På dag 4 eller 5 ska blastocysten utväxt vara klar för uppdelning beroende på dess storlek. Den ideala storleken för TS cell uppdelning illustreras i figur 3B. Tvätta kulturer gång med 0,5 ml PBS. Tillsätt 100 ml 0,25% trypsin / EDTA och inkubera 5 minuter vid 37 ° C, 5% CO _2. Bryt utväxt i små klumpar genom att pipettera upp och ned kraftigt med en P100 pipetteman. Stoppa trypsinization genom att lägga till TS-70cm-1.5F4H (30% TS medium, 70% MEF-CM plus 1,5 FGF4/Heparin) i brunnen. Ändra medelstora 8 timmar efter nedbrytning och fortsätter att mata cellerna var 2 dagar.
10. Mellan dag 6 och 10 (mycket varierande) TS cell kolonier kan observeras. De har platt, epitelceller plåt som morfologi med en tydlig koloni gräns (figur 2C). Fortsätt att mata kulturer var 2 dagar
11. När TS cellerna når 50% confluency (vanligtvis mellan dag 15 och 20), tvätta en gång med PBS och tillsätt 100 ml 0,25% trypsin / EDTA. Pipettera upp och ner under trypsinization att säkerställa ett nära encelliga suspension. Stoppa trypsinization genom att lägga till TS-70cm-1.5F4H och övergång till nya 6-bra eller 60mm plattor som innehåller mitomycin C-behandlade MEF matare (2,5 x 10 ⁵ cells/6-well eller 5 x10 ⁵ cells/60mm plåt).
12. Ändra medelstora 8 timmar efter passagen och fortsätta att mata de kulturer var 2 dagar.
13. Efter en eller två passager (3-5 dagar mellan passager) på MEF matare kan TS cellerna odlas utan dem. Eftersom MEFs fäster den kultur plattan mycket snabbare än TS cellerna efter trypsinization, kan en sådan skillnad i tillhörande kurs som skall användas för att separera TS celler från MEF matare. Efter att ha passerat de odlade cellerna, inkubera dem vid 37 ° C, 5% CO ₂ i 30 min. De flesta MEFs kommer att fästa på plattan och TS befolkningen stannar kvar i suspension. Överför supernatanten till en ny platta. Upprepa denna process för flera passager för att få en ren TS befolkning.
14. Behåll TS celler i TS-70cm-1.5F4H och föra dem var 4 dagar (1:10 till 1:20 split) eller när kulturen når 70% confluency. Passerar cellerna med hög densitet (högre än 1:05 split) eller odla dem när alltför konfluenta kan orsaka deras differentiering.
15. Identitet TS celler kan bekräftas genom immunfärgning av en cell markör Cdx2 (Figur 3).

Frysning TS celler

1. Förbered 2x frysning medelstora (50% FBS, 30% TS medelstora och 20% DMSO).
2. Collect TS celler genom trypsinization, följt av centrifugering vid 450 för 6 min. Resuspendera dem i TS medium med lika volym 2x frysning medium.
3. Frys cellerna långsamt med hjälp av en isopropylalkohol kammare vid -70 ° C och transfer till flytande kväve efter 24-48 timmar.
4. En 60 mm plåt (70% konfluenta) hålls vanligen i 2 flaskor.

Upptining TS celler

1. Snabbt tina flaskan i 37 ° C, samla ihop dem i 10 ml TS medier genom centrifugering (450, 6 min), och återsuspendera i 30% TS media, 70cm-1.5F4H.
2. En injektionsflaska med celler är seedade i en 60 mm plåt.

TS celldifferentiering i TGC

Differentiering av TS celler till celler trofoblasten jätte (TGCs) kan induceras genom indragning av MEF-CM, FGF4 och heparin. Den TGC fenotyp (stora kärnor) kan detekteras fyra dagar efter induktion (Tanaka et al., 1998 och Chiu et al. 2008). Immunfärgning av p450scc upptäcka uttryck för denna TGC markör i den differentierade kulturen (Figur 4A). Flödescytometrisk analys av PI (propidiumjodid) färgade celler visar vidare förekomsten av differentierade celler som innehåller högre DNA-innehåll (Figur 4B). Dessa resultat tyder på att TS celler genomgå endoreduplikation att bli polyploida TGCs.

Representativa resultat

Figur 1. Dissekering av musen uteri. (A) Placering av livmoder indikeras med pilar. (B) Klipp tvärs över korsningen och livmoderhals som visas. (C) Skär av livmodern strax nedanför äggledare (OD) under äggstocken (OV). (D) Bilden av livmoder.

Figur 2. Representant bilder illustrerar mus blastocysten, blastocysten utväxt och trofoblasten koloni. (A) En mus blastocyst samlats vid E3.5 visas. ICM, inre cellmassan, MT, väggmålning trophectoderm, PT, Polar trophectoderm. (B) A trofoblasten utväxt på MEF matare visas. TS, trofoblasten stamceller. (C) En trofoblasten stamceller koloni visar en tydlig kant på MEF matare. Pilarna visar cellen gränsen.

Figur 3. Identifikation av TS celler genom immunfärgning analys. TS (AD) och ES (kontroll, EH) celler är föremål för markör identifiering. Celler är immunostained med antikroppar att känna igen Oct4 (A, E) eller Cdx2 (B, F) och counterstained genom DAPI (C, G) som presenteras i fusionerade bilder (D, H). Skala Bar, 50 ìm.

Figur 4. Differentiering av TS celler in vitro. (A) diverse (Undiff) eller differentierade (Diff) celler i kulturen undersöktes för uttrycket av en TGC markör counterstained p450scc (grön), med DAPI (röd). (B) flödescytometrisk analys av den differentierade celler, färgas med PI, mäter DNA-innehåll (M1, två till fyra kopior, M2, mer än fyra kopior). M2 befolkningen representerar polyploida trofoblasten celler.

Discussion

I denna video visar vi processen att samla E3.5 blastocyster från livmoder och experimentella förfaranden för att fastställa TS cellinjer. Vi beskriver också tillståndet att upprätthålla stemness av TS celler och att få deras differentiering till differentierade celler. Två viktiga steg för att få rena linjer TS cell är tidpunkten för utväxt uppdelning (steg 9) och bearbetning första passagen (steg 11). Det har rapporterats att primitiva endoderm-härledda celler kan uppstå i kulturen efter omfattande blastocysten växa ur i steg 9 eller överväxt av TS kolonier (> 50% confluency) i steg 11 (Kunath et al., 2005). Även om primitiva endoderm-härledda celler kan identifieras genom sin särpräglade morfologi med en rundad cell form och reducerad cell-cell kontakt jämfört med TS cellerna, är det svårt att ta bort dem från kulturen eftersom de växer bra i TS medium och inte verkar kräva MEF matare eller FGF4.

De differentierade TGCs kan uppstå ständigt i TS kulturen även i närvaro av MEF-CM och FGF4. Om en ren TS befolkning önskas kan dessa differentierade celler separeras på basis av skillnaden tillhörande priser. Liknande MEFs, TGCs fäster odlingsplattor snabbare än TS celler, vilket ger ett förfarande som möjligt att få en ren TS befolkning som beskrivs i steg 13. Alternativt, eftersom TGCs är starkt vidhäftande och mer motståndskraftiga mot trypsinization, också en ren TS befolkning kan erhållas genom snabb trypisinization (3 min), följt av insamling av suspenderade TS cellerna.

Materials

Reagents

TS medium: RPMI-1640, 20% FBS, 1 mM sodium pyruvate, 100 mM beta-mercapt–thanol and 100 mg/ml penicillin-streptomycin.

Mitomycin C: Dissolve 2 mg mitomycin C (Sigma M-0503) in 2 ml PBS and add this 2 ml mixture into 200 ml TS medium (10 ng/ml). Make 20 aliquots (10 ml) and store at -20°C until use. Add one aliquot per 100 mm plate.

Mouse embryonic fibroblast-condition medium (MEF-CM): Plate MEFs in 100 mm plates (1 x 106/plate). Next day, add 10 ml TS medium per dish and continue to culture for 48 hours. Collect the culture medium, filter them (0.45 mm) and store at -20°C in 35 ml aliquots. Thaw each aliquot when needed which can be stored at 4°C. The MEFs can be used to prepare for two more batches of CM before they become confluent.

PBS/BSA: Dissolve BSA, fraction V (Sigma A3311, 0.1% (w/v)) in PBS (10 ml), filter through a 0.45 mm syringe filter and make 1 ml aliquots in 1.5 ml tubes. Store at -70°C and thaw one tube when needed to prepare FGF4.

FGF4 (1000x): Resuspend lyophilized FGF4 (Sigma F8424, 25 mg) with 1 ml of the PBS/BSA solution. Mix well and make 10 aliquots (100 ml) into 1.5 ml tubes and store at -70°C. Thaw each tube when needed and store the remaining at 4°C, do not re-freeze. Dilute 1000 times in TS medium to obtain 1x FGF4 (25 ng/ml).

Heparin (1000x): Resuspend heparin (Sigma H3149, 10,000 units) in PBS to a final concentration of 1 mg/ml (1000x). Make 100 ml aliquots into 1.5 ml tubes and store at -70°C. Thaw aliquots when needed and store the remaining at 4°C, do not re-freeze. Dilute 1000 time in TS medium to obtain 1x heparin (1 ng/ml).