Summary
Dieses Video zeigt Experimente mit anschließender Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkungen durch den Einsatz von Mikro-gemusterten Oberflächen. Der Ansatz bietet die Möglichkeit, Protein-Wechselwirkungen in lebenden Zellen zu erkennen und verbindet hohe Durchsatz mit der Möglichkeit, quantitative Informationen zu extrahieren.
Abstract
Die Aufklärung der Interaktion Netzwerk von Molekülen
Protocol
Mikrokontaktdrucken:
- Cut out Bereich der Mikrostruktur des PDMS-Stempels mit einem Skalpell
- Wash das Feld mit der Mikrostruktur durch Spülen mit Ethanol (100%) und destilliertem Wasser.
- Trocknen Sie die PDMS-Stempel mit Stickstoff oder Argon.
- Je 50 ul BSA-Cy5 Arbeit-Lösung (0,67 mg / ml) auf die PDMS-Stempel, so dass die gesamte Mikrostruktur Feld mit Lösung bedeckt ist. Inkubieren für 30 min bei Raumtemperatur.
- Waschen Sie die Mikrostruktur Bereich durch Spülen mit Phosphat-gepufferter Saline (PBS) und destilliertem Wasser.
- Trocknen Sie die PDMS mit Stickstoff oder Argon.
- Legen Sie die PDMS-Stempel unter seinem eigenen Gewicht auf die Mitte einer Epoxy-beschichtete Deckglas und Inkubation für 30 min bei Raumtemperatur in einer Petrischale.
- Beschriften Sie die Position der PDMS-Stempel auf der Rückseite des Deckglases und Streifen der Stempel aus der Folie mit einer Pinzette.
- Stick eine sichere Abdichtung Hybridisierung Kammer über die Mikrokontaktstruktur bedruckte Bereich auf dem Deckglas. Das Label hilft zu lokalisieren der Mitte des Feldes.
- Pipette 60 ul Streptavidin Arbeit-Lösung (50 pg / ml) in die Reaktionskammer und inkubieren Sie die Probe für 60 min bei Raumtemperatur.
- Waschen Sie die Probe mit 1 ml PBS, indem Sie die Puffer in einem Hafen der Kammer zu entfernen und gleichzeitig an den zweiten Port mit einer Pumpe.
- Pipette 60 ul biotinylierten Antikörper Arbeit-Lösung (10 pg / ml in PBS mit 0,1% Tween 20 ergänzt, "PBST") in die Reaktionskammer und Inkubation für 60 min bei Raumtemperatur.
- Waschen Sie die Probe mit 1 ml PBST und anschließend 1 ml PBS, indem Sie die Puffer in einem Hafen der Kammer und Entfernen wieder auf den zweiten Port mit einer Pumpe.
- Bewahren Sie die mikrostrukturierten Oberflächen in PBS im Dunkeln bei Raumtemperatur, bis die Zellen bereit für die Aussaat sind.
Die Inkubation von Zellen auf der mikrostrukturierten Oberfläche:
- Wachsen adhärente Zellen zu 50% Konfluenz in einer 3 cm Gewebekulturplatte.
- Lösen Sie exprimieren Köder und Beute Proteine von Interesse mit Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)-Lösung und Zentrifuge 5 min bei 1.000 Umdrehungen pro Minute.
- Überstand verwerfen und lösen das Zellpellet in dem entsprechenden Wachstumsmedium.
- Zentrifuge 5 min bei 1.000 Umdrehungen pro Minute.
- Überstand verwerfen und lösen das Zellpellet in geeigneten Nährmedium.
- Tauschen Sie die PBS aus der Reaktionskammer auf den mikrostrukturierten Deckglas von 60 ul der Zellsuspension.
- Erstellen einer feuchten Kammer durch Einweichen eines sterilen Tupfer in destilliertem Wasser und legt es in die Petrischale, um die Probe vor Trockenlauf zu verhindern.
- Inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 37 ° C in einer 5% CO 2-Atmosphäre auf den mikrostrukturierten Oberflächen.
- Vor einer Analyse der Zellen unter dem Mikroskop, den Austausch des Mediums durch gepufferte Salz Hank s Lösung mit Ca 2 + und Mg 2 +.
Mikroskopie:
- Das Deckglas wird auf einer geeigneten Halterung gelegt und die Zellmorphologie unter Weißlicht-geprüft.
- Die Qualität der BSA-Cy5 Muster wird durch Anregung bei 647 nm überprüft.
- Mikrostrukturen von fluoreszierenden Beute-Protein (GFP oder YFP) sind bei 488 oder 514 nm unter Total Internal Reflection (TIR) Anregung aufgenommen.
Repräsentative Ergebnisse:
Wenn es Wechselwirkungen zwischen den Target-Proteine in den Zellen auf einer mikrostrukturierten Oberfläche gewachsen ist, wird die Beute folgen den Köder Umverteilung. Die resultierende Mikrostruktur können visualisiert werden, indem die Fluoreszenz-Markierung der Beute-Protein. Wichtig ist der Kontrast erhalten ein direktes Maß für die Stärke der Wechselwirkung (siehe Abbildung 1). Daher ist eine einfache Auswertung der Interaktion von zwei Proteinen möglich wird - ohne die Notwendigkeit einer weiteren Prozess der gemessenen Primärdaten.
Abbildung 1. Umlagerung des Köders in der lebenden Zelle Plasmamembran an unterschiedlichen Stärke der Wechselwirkung. TIR Bilder von T24-Zellen mit (a) CD71-GFP auf CD71-Antikörper, transfiziert, (b) CD4 und cytosolische YFP auf CD4-Antikörper und (c) GPI-GFP-DAF auf CD59-Antikörper microbiochips gezeigt. Die Daten sind charakteristisch für stark (a), no (b) oder schwache Wechselwirkung (c). (A) aus (Weghuber et al., In press), (b) aus (Schwarzenbacher et al., 2008) wiedergegeben.
Discussion
Das dazugehörige Video zeigt ein Verfahren zum Nachweis von Protein-Protein-Wechselwirkungen in der Plasmamembran von lebenden Zellen (Schwarzenbacher et al, 2008;. Brameshuber et al, 2009;.. Weghuber et al, in press). Im Prinzip kann jeder TIRF-basierte Mikroskopie-Plattform als Anzeige verwendet werden. Nur wenn eine hohe Empfindlichkeit gewünscht wird (zB für die Detektion einzelner Moleküle), werden fortgeschrittene Mikroskope verlangt werden. Um dies zu erreichen beste Ergebnisse die folgenden kritischen Punkte während des Herstellungsprozesses erfordern besondere Aufmerksamkeit:
- Shop Cy5-Stammlösung bei schlechten Lichtverhältnissen zu vermeiden Bleichen des Fluorophors und bereiten die BSA-Cy5 Arbeit Lösung frisch vor dem Mikrokontaktdrucken.
- Achten Sie darauf, nicht auf die Mikrostruktur auf dem PDMS Kratzer mit der Pipettenspitze und inkubieren Sie die Probe bei schlechten Lichtverhältnissen zu vermeiden Bleichen des Fluorophors.
- Legen Sie das Deckglas auf einem sterilen Tupfer zu verhindern Verkleben der Glasscheibe auf die Petrischale. Sobald die PDMS-Stempel auf den Objektträger geklebt hat, bewegen Sie es nicht.
- Vermeiden Sie Luftblasen in der Reaktionskammer und inkubieren Sie die Probe bei schlechten Lichtverhältnissen zu vermeiden Bleichen des Fluorophors.
- Lassen Sie sich nicht die Probe trocken für mehr als 2 Minuten, um die Bildung von Salzkristallen zu vermeiden.
- Für die Ablösung der Zellen nicht verwenden Trypsin als es Abspaltung der extrazellulären Domäne des bisher geäußert Membranproteinen. Vermeiden Trypsin wird hilfreich sein, die für Proteine mit niedrigen Fluktuationsrate zu Mikrostrukturen unmittelbar nach Anheftung der Zellen auf der Oberfläche bilden.
- Kontrollieren Sie die Anzahl der inkubierten Zellen im Mikroskop und stellen Sie sicher, dass die Zellen nicht erreichen mehr als 30-50% Konfluenz. Stellen Sie sicher, dass die übermäßige Zellen sofort sind auf die schnelle Befestigung von Zellen auf der Antikörper-beschichteten Oberfläche entfernt.
- Nur Folien mit hoher Qualität BSA-Cy5 Muster können zur weiteren Analyse verwendet werden.
- Stabile Expression des fluoreszierenden Proteins Beute ist vorzuziehen aufgrund der größeren Anzahl von Zellen, die pro Scan analysiert werden kann.
- Angemessene TIRF Einstellung ist unerlässlich, um Muster durch cytosolische Hintergrund sichtbar zu machen.
Die Mikro-Strukturierung Technik bietet mehrere Möglichkeiten für die Analyse von Protein-Protein-Interaktionen. Erstens, zusammen mit der Quantifizierung der lokalen, räumlich aufgelöster Protein-Protein-Interaktionen auch die Detektion von schwachen oder indirekten Wechselwirkungen ist, ohne den Nachteil, dass eine hohe Anzahl von falschen Positiven oder Negativen möglich. Zweitens ermöglicht die Forscher, um Protein-Protein-Wechselwirkungen in der Plasmamembran von lebenden Zellen, die nur schwer durch biochemische Ansätze wie die 2-Hybrid-Screen zu erreichen, ist zu analysieren. Drittens der Ansatz ermöglicht die Erkennung von Köder-Beute-Interaktionen, moduliert durch Veränderungen der Umwelt wie die Temperatur, die Anwesenheit verschiedener Proteine oder andere Moleküle oder post-translationale Modifikationen sind. So ist die Assay ermöglicht die Screening-Modulatoren einer bestimmten Interaktion Paar im Kontext der lebenden Zellen. Darüber hinaus, indem die Flächendichte der Erfassung Liganden oder die Verwendung von monovalenten Liganden, wird die Analyse der Ruhezustand möglich. Schließlich, wenn ausreichende Scan-Plattformen verwendet werden, ist die Zahl der analysierten Zellen hoch genug, um einen hohen Durchsatz Anforderungen der Pharma-Unternehmen für Wirkstoff-Screening (Ramm, 2005) überein.
Disclosures
Das Video enthält Bilder, die von Olympus, von der Homepage des Visualization Research Lab entnommen, Brown University zur Verfügung gestellt wurden oder reproduziert aus (Kim et al., 2003).
Acknowledgments
Wir möchten Quentina Beatty, Universität Linz, Österreich, für ihre freundliche Hilfe, Katharina Strub, Universität Genf, Schweiz danken, für die hCD71-GFP-Konstrukt, und Daniel Legler, Universität Konstanz, der Schweiz, für die GPI-GFP -DAF zu konstruieren. Und die GEN-AU Projekt des österreichischen Bundesministeriums für Wissenschaft und Forschung; Diese Arbeit wurde vom FWF (Projekt Y250-B03 FWF) unterstützt.
References
- Brameshuber, M., Schwarzenbacher, M., Kaltenbrunner, M., Hesch, C., Paster, W., Weghuber, J., Heise, B., Sonnleitner, A., Stockinger, H., Schuetz, G. J. Reply to "Uncoupling diffusion and binding in FRAP experiments. Nat. Methods. 6, 183-184 (2009).
- Kim, P. W., Sun, Z. J., Blacklow, S. C., Wagner, G., Eck, M. J. A Zinc Clasp Structure Tethers Lck to T Cell Coreceptors CD4 and CD8. Science. 301, 1725-1728 (2003).
- Ramm, P. Image-based screening: a technology in transition. Curr. Opin. Biotechnol. 16, 41-48 (2005).
- Schwarzenbacher, M., Kaltenbrunner, M., Brameshuber, M., Hesch, C., Paster, W., Weghuber, J., Heise, B., Sonnleitner, A., Stockinger, H., Schutz, G. J. Micropatterning for quantitative analysis of protein-protein interactions in living cells. Nat. Methods. 5, 1053-1060 (2008).
- Weghuber, J., Brameshuber, M., Sunzenauer, S., Lehner, M., Paar, C., Haselbruebler, T., Schwarzenbacher, M., Kaltenbrunner, M., Paster, W., Heise, B., Sonnleitner, A., Stockinger, H., Schutz, G. J. Detection of protein-protein interactions in the live cell plasma membrane by quantifying prey redistribution upon bait micropatterning. Methods in Enzymology. , Forthcoming Forthcoming.
