Summary
Luciferas modifierade mänskliga hjärnan tumörxenografter kan fastställas intracranially i athymic möss, med efterföljande övervakning av tumörtillväxt och svar på terapi med bioluminescens avbildning. I kombination med överlevnad analys, är mareld övervaka ett viktigt sökverktyg för preklinisk testning av behandlingar som övervägs för behandling av hjärntumörer.
Abstract
Transplantation modeller med hjälp av mänskliga celler hjärntumör har tjänat en väsentlig funktion inom neuro-onkologi forskning i många år. Förr i tiden bestod den vanligaste förfarandet för tumour xenograft upprättandet av den samling celler från kultur flaskor, följt av subkutan injektion av de insamlade celler i immunsupprimerade möss. Detta tillvägagångssätt som fortfarande ser flitig användning i många laboratorier har det skett en betydande förskjutning av tyngdpunkten under det senaste decenniet mot orthotopic xenograft etablering, som i fallet av hjärntumörer kräver tumörcellens injektion i lämpliga neuroanatomiska strukturer. Eftersom intrakraniell xenograft anläggning eliminerar möjligheten att övervaka tumörtillväxt genom direkta mätningar, till exempel med hjälp av skjutmått, den förskjutning av tyngdpunkten mot orthotopic xenograft hjärntumör modeller har krävt utnyttjandet av icke-invasiv imaging för bedömning av tumörbörda i värddjur. Av de tillgängliga avbildningsmetoder är mareld övervakning allmänt anses att erbjuda den bästa kombinationen av känslighet, ändamålsenlighet och kostnad. Här kommer vi att demonstrera förfaranden för orthotopic hjärntumör etablering, och för övervakning av tumörtillväxt och svar på behandlingen vid test av experimentella terapier.
Protocol
1. Tumör cellberedningen.
Celler för mänskliga xenografter hjärntumör kan köpas antingen från tumörer propagerade som subkutan utväxter i athymic möss, eller från cellkultur. Utnyttjande av både cell källor diskuteras nedan, tillsammans med demonstration av en metod för cell implantation.
För att förbereda celler från subkutana tumörer för överföring till intrakraniella facket, är censurerade flanken tumörer placeras i kultur rätter, där vävnaden är initialt sönderdelas med skalpell och sedan mekaniskt störs av repetitiva pipettering för att skapa en suspension cell aggregat 1. Cellen sammanlagda fjädring leds sedan genom ett 70 mikroM nylon mesh-filter för att producera en enda cellsuspensionen lämplig för intrakraniella injektion. Cellsuspensionen centrifugeras vid 1000 rpm i 10 minuter vid 4 ° C, och supernatanten aspireras innan resuspending cellpelleten i en lämplig volym av serum-fria medier att framställa en slutlig arbetar koncentration (se nedan). För att förbereda etablerade cellinjer för intrakraniell implantation, celler skördas trypsinizing monolager, eller genom att samla neurosphere fjädring kulturer, sedan centrifugering och resuspending cellerna enligt ovan 2. Antalet injicerade celler varierar beroende på neuroanatomiska placering injektion. För supratentoriella injektioner vi injicerar rutinmässigt 3-5 x 10 5 celler i 3 mikroliter serum-fria medier (DMEM), medan hjärnstammen injektioner 3, så få som 5 x 10 4 celler injiceras i 0,5 mikroliter. Injektion av större volymer än vad som rekommenderas kan resultera i tumörceller reflux genom nålen tarmkanalen, med resulterande exophytic (Figur 1), snarare än intrakraniell tumörtillväxt. Efter att dra tillbaka provet för intrakraniell injektion ska den återstående cellsuspensionen placeras i is, med innehåll blandas ofta så att lämplig koncentration när du fyller i intrakraniell tumör etablering bland medlemmarna i en injektion serie.
2. Tumörcell Implantation
Obs, har alla förfaranden som beskrivs nedan granskats och godkänts av Institutional Animal Användning och skötsel kommittén vid University of California San Francisco.
- Operationsområdet bör förberedas genom att spraya alla ytor med ett desinfektionsmedel, såsom 2% klorhexidin lösning. Efter användning av desinfektionsmedel, skall följande leveranser placeras i operationsområdet:
- Värmedyna för att bibehålla temperaturen mus kroppen
- Två små petriskålar, en som innehåller 3% väteperoxid, och en innehållande 2% klorhexidin
- Steril gasbinda och bomull kompresser
- Sterila engångs skalpeller
- Autoklaveras kirurgisk häftapparat
- För anestesi ett injicerade bedövningsmedel bör användas, normalt en ketamin-xylazin blandning.
- När en mus är sövda, är hårbotten som utarbetats av badda flera gånger med en bit steril gasbinda doppas i klorhexidin lösning. Ögonsalva bör tillämpas för att upprätthålla tillräcklig fuktighet under förfarandet. Med en steril skalpell, komplett en sagittal snitt över parieto-occipital ben, ca 1 cm lång. Den exponerade skallen Ytan är då rengöras med en bomullspinne indränkt i en 3% väteperoxid lösning. Den bregma borde vara uppenbart vid det här laget (se video).
- Koordinaterna för injektion av tumörceller kommer att variera beroende på den önskade platsen för tumören etablering. Följande representerar den procedur vi använder för intracerebrala tumörer etablering 2 i ett neuroanatomiska plats där många hjärntumör patienter upplever tumörutveckling. Andra platser av intresse i hjärntumör forskning inkluderar bryggan, för anatomisk modellering av hjärnstammen tumörer 3 och subdural injektioner för modellering var meningeal tumörer 4. Innan tumörceller injektion, använd en steril 25 gauge vass nål för att punktera skallen vid 2 mm till höger om bregma och 1 mm främre till coronal suturer och därigenom skapa en öppning för injektion av tumörceller (se video). Detta förfarande fungerar bra för både möss och råttor (22 gauge nål vid råtta).
- Före ritning celler i sprutan, blanda innehållet av cellsuspensionen genom att knacka med fingret. Ladda sprutan med önskad mängd cellsuspension Var noga med att undvika att skapa luftbubblor. Utsidan av sprutan bör då rengöras med en tuss att torka av utsidan fri från vidhäftande celler, som bidrar till att förhindra extrakraniell tumör etablering och tillväxt (Figur 1A). För att säkerställa att lämplig injektion djupet uppnås, använd en skalpell för att skära 3mm från den spetsiga änden av en P20 pipetteman spets. Denna del av spetsen kan monteras över sprutan och kommer att agera för att begränsa injektionen djup, och dessutom se till att TIp på sprutans nål är 3mm från undersidan av skallen. Lägg sprutan vinkelrätt mot skallen och i hålet tidigare skapade, och långsamt injicera cellsuspension (en 3μL suspension ska injiceras under en 1 minut period). En olämplig vinkel spruta insättning kan resultera i intraventrikulära injektion av celler och efterföljande spinal spridning (Fig. 1B: Höger) Efter avslutad injektion, lämna nålen på plats för ytterligare en minut, sedan sakta tillbaka (se video): dessa åtgärder kommer att bidra till att minska tumörceller reflux.
- Som ett alternativ till egen hand eller på fri hand förhållningssätt till intrakraniella tumörceller implantation 5, kan man använda en liten ram djur stereotaktisk (panel F i schematisk översikt), som i allmänhet främjar mer konsekvent injektion plats, men på bekostnad av stora mängder processuella tiden. Enligt vår erfarenhet kan två kirurgiska personal injicera så många som 60 möss / timme när man använder fri hand strategi, medan maximal insprutningshastighet med ett litet djur stereotaktisk ram är ca 15 möss / timme. Processuella lämpligheten är en viktig faktor vid injektion av stora serier av möss, och hjälper till att minska den tid under vilken tumörceller, som injiceras, är kvar på isen.
- Rengör skallen med 3% väteperoxid och torr med en steril torr bomullspinne. Applicera sterilt ben vax till hålet. Med hjälp av en pincett, rita hårbotten tillsammans över skallen och krampa att stänga. För optimal läkning skall hårbotten häftas med dermis på varje sida i hårbotten mot varandra (undersidan mot undersidan). Den häftade hårbotten bör rengöras med Klorhexidin lösning, och buprenorfin sedan ges som subkutan injektion under postoperativ smärtlindring.
- Övervaka alla möss postoperativt tills de blir ambulerande och behålla normal aktivitet. Normalt är återhämtningstiden ca 30 minuter.
3. Bioluminescence Övervakning av tumörtillväxt
- Bakgrund. Bioluminescence imaging (BLI) baseras på oxidation av luciferin [D-(-) -2 - (60-hydroxi-20-benzothiazolyl)-thiazone-4-karboxylsyra] i närvaro av syre och adenosintrifosfat (ATP). Denna reaktion katalyseras av enzymet luciferas, som omvandlar kemisk energi till fotoner med resulterande utsläpp av ljus. Mänskliga celler kan modifieras för att uttrycka luciferas (se nedan), med bara luciferas-uttryckande celler med förmåga att avge ljus i närvaro av luciferin substrat. Det är minimal bakgrund luminiscens från djur som värdar som behandlats med luciferin, så att det är en mycket god signal-brus-förhållande för att upptäcka luminiscens utsläpp från luciferas-modifierade tumörceller, vilket gör att mycket känsliga övervakning av tumörtillväxt och terapisvaret in vivo. Dessutom har luciferas och dess substrat, luciferin, visat sig vara icke-giftig för däggdjursceller, och vi har observerat några funktionella skillnader mellan celler som uttrycker luciferas i förhållande till motsvarande omodifierade celler. Luciferin passerar lätt cellmembran och blod-hjärnbarriären efter intraperitoneal (ip) eller intravenös (iv) injektion i möss, vilket möjliggör avbildning av varje fack som innehåller luciferas-modifierade celler. Nivån på photon emission och spektrum av utsänt ljus från luciferas modifierade cellerna är tillräcklig för att penetrera vävnader av små försöksdjur, t.ex. möss och råttor, och kan upptäckas externt med svagt ljus bildkameror. Den icke-invasiv art mareld bildhantering möjliggör upprepad övervakning av tumörtillväxt och terapisvar i enskilda djurförsök.
- Inopererade cell källor bör stabilt modifieras för eldfluga luciferas uttryck. Sådana celler källor kan köpas eller tillverkas i enskilda laboratorier som använder lentivirus som har konstruerats för konstitutivt uttryck av luciferas. Vi rekommenderar starkt att använda celler modifierade med luciferas kodning lentivirus, snarare än plasmid, att säkerställa stabila cellulära uttrycket av luciferas in vivo, vilket är nödvändigt för kvantitativa luminiscens avbildning för att tillhandahålla korrekt indikation på förändringar i tumör börda för enskilda djuret ämnen som är flera gånger avbildade under ett experiment.
- BLI övervakning. Vi rekommenderar att genomföra kvantitativa mareld imaging (qBLI) 1x-2x vecka med början en vecka efter tumörceller injektion. Vår qBLI sker via de IVIS Lumina bildbehandling (klave Life Sciences), och våra resultat visar liknande data erhålls i att använda IVIS Lumina, den IVIS 150, eller IVIS 200 bildbehandling. Som förberedelse för bildkommunikation, möss samtidigt bedövas med ketamin / Xylazine och administreras luciferin (D-luciferin kaliumsalt, 150 mg / kg, klave Life Sciences) via injektion i bukhålan med möss avbildas 12 minuter efter injektionen. Farmakokinetiken för luciferin visar att tiden mellan förvalttration av luciferin och bestämning av cellens luminiscens bör vara mellan 10-15 minuter efter injektion av luciferin, för att få maximal luminiscens utsläpp och största känsligheten för upptäckt. Den tid som valts under 10-15 minuters tidsintervall bör bibehållas som konstant bland de djur som är som avbildas. Det är oerhört viktigt att upprätthålla konsekvens i tiden mellan injektion av luciferin och få BLI avläsningar. Regioner av intresse omfattar intrakraniell området signal definieras med hjälp av programvara levande bild (figur 2) och den totala photons/s/sr/cm2 (fotoner per sekund per steradian per kvadrat cm) har registrerats (se video).
- Dataanalys. I tumörtillväxt och terapi svar följs upp på enskilda djur, rekommenderar vi behandling grupper om minst 8 för att öka den statistiska säkerheten i slutsatserna om tumörsvar, eller bristen därav, till terapi. När det gäller att presentera qBLI resultat, luminiscens avläsningarna omvandlas till normaliserade värden genom att dela varje mus är luminiscens, som erhållits under och efter slutförandet av terapeutiska regimen, med motsvarande maximal förbehandling luminiscens läsa 6,7. För överlevnad analys är Kaplan-Meier-estimatorn 8 används, och från vilka överlevnadskurvorna genereras, och median överlevnad värden som bestämts. Skillnader mellan överlevnadskurvorna jämförs med ett log-rank test 9.
- Hämtning av hjärnan för senare analys av behandlade och obehandlade tumörer. När djur dödshjälp bör hjärnan på musen snabbt exciderad (se video), och antingen placeras i formalin för senare analys av tumör morfologi och immunohistokemi, eller ska monteras i oktober för provet frysning.
4. Representativa resultat
I exemplet som visas i figur 3A, möss fick intrakraniell injektion tumörcellen övervakas för intrakraniell luminiscens till varandra betyder luminiscens värden som anges progressiv tumörtillväxt, och vid vilken tidpunkt behandling inleddes (grå pilen börjar på dag 34: erlotinib administreras dagligen med 150 mg / kg tills de behövs dödshjälp). Luminiscens värden för varje mus är inställda på ett normaliserat värde av 1 vid tidpunkten för behandlingsstart med efterföljande luminiscens avläsningar för varje mus normaliserade till dess slutliga förbehandling avbildning värde. Som ett exempel, en mus med en slutlig förbehandling luminiscens läsning av 2,0 x 10 7 fotoner / sek vid dag 34, vars luminiscens hade ökat till 6,0 x 10 7 fotoner / sek vid dag 38, skulle ha en dag 38 normaliserat luminiscens värde på 3,0. Genomsnittlig normaliserad bioluminescence och motsvarande standardfel för kontroll-och behandlingsgrupperna ritas för varje avbildning tidpunkt. I detta exempel är en signifikant skillnad i genomsnittliga normaliserade luminiscens vid det första avbildning tidpunkt efter det att behandlingen påbörjas (dag 38), med den skillnaden i genomsnittlig grupp luminiscens visar ytterligare ökning vid påföljande tidpunkter. I de flesta fall är antitumöraktivitet av terapi, vilket framgår av qBLI, åtföljs av en motsvarande signifikant skillnad i överlevnad (dvs p <0,05), vilket är fallet här (Figur 3B). Paneler 3C och 3D visar intilliggande hematoxylin och eosin och anti-EGFR färgade snitt av mus hjärnan som erhålls vid köp av dödshjälp, efter placering av opererande hjärnan i formalin och efterföljande paraffin-inbäddning för sektionering.
Figur 1. Tecken på intrakraniell injektion fel. A) exophytic (extrakraniell) tumörtillväxt (röd cirkel) kan orsakas av för stor injektionsvolym, kvarvarande cellsuspension fäst i sprutan, eller från att dra tillbaka i sprutan för snabbt efter att injicera tumörceller. B) Att injicera tumörceller i ventriklarna kan orsaka spinal spridning av tumören (mus till höger), i motsats till ordentligt injicerade tumörceller, den signal som förblir lokaliserad till injektionsstället (musen till vänster).
Figur 2. Värme kartbild representationer av mareld intensitet för representativ möss från kontroll (vänster) och behandling (till höger) grupper av en terapi svar experiment. The Living bildbehandlingsprogram kan ställas in för att definiera områden av intresse (röda cirklar) eller instrument operatörerna kan definiera områden av intresse manuellt. För att använda bilder som dessa för figur konstruktion, rekommenderar vi att instrumentet operatören visar värme kartbilder med samma mareld olika heat map (övre delen av bilden), för att ge visuell representation av omfattningen av mareld skillnaden mellan djurförsök.
Figur 3. Mareld, överlevnad och tumörvävnad analys från ett experiment där terapeutiskt svar är uppenbar. A) Plotta av medelvärden mareld avläsningar för kontroll och behandling möss grupp, med standardfel som anges för varje avbildning punkt. B) Överlevnad tomten för samma möss, p-värde fastställas genom användning av log-rank test 7. C) H & E färgade delen av musen hjärnan med tumör. D) EGFR färgade avsnitt. E och F) förstoringar angivna områden från panelerna C och D, respektive, med panel E visar negativ färgning för tumörsuppressorgen proteinet PTEN.
Discussion
Orthotopic (intrakraniell) hjärntumör xenograft etablering ger en lämplig mikromiljö 10 för modellering CNS cancer att testas för terapeutiskt svar. Denna typ av modellering ger dessutom information om terapeutiska tillgång till hjärnan och hjärntumör, vilket är oerhört viktigt att avgöra om en experimentell läkemedlet bör avancerade till klinisk prövning utvärderas på patienter. Eftersom mängden intrakraniell xenograft tumören inte kan mätas direkt, t.ex. genom bromsok, kräver longitudinell övervakning av intrakraniell tumörtillväxt och terapisvar icke-invasiv imaging, med vår erfarenhet visar bioluminescens bildbehandling som den mest praktiska metoden för experiment vars primära mål är att bedöma omfattning av tumör svar på terapi. När resultatet av mareld avbildning kombineras med djur ämne överlevnad analys, två datauppsättningar ger en kraftfull och pålitlig metod för att utvärdera experimentella terapeutisk effekt.
Slutligen är det ytterst viktigt att intrakraniell hjärnan tumörxenografter skördas från avlivas djurförsök för att bedöma morfologiska och molekylära effekter av behandlingen, och för detta vi föredrar hela hjärnan resektion vid tidpunkten för dödshjälp, med bevarandet av opererande hjärnan för senare analys.
I den föregående presentationen har gjorts specifikt för hjärntumör forskning, begreppen är säkert generalizeable till andra mänskliga cancerformer som är öppna för orthotopic modellering hos gnagare.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
NINDS bidrag NS49720 och NS65819 och GNI bevilja CA97257Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Disposable Scapels | Feather Safety Razor Co, Ltd. | 2975 | No.21 |
| Heating Pad | Dunlap | HP950 | |
| Gauze | Fisher Scientific | 22028563 | |
| Cotton Swabs | Fisher Scientific | 23-400-100 | |
| 2% Chlorhexidine | Fisher Scientific | NC9756995 | |
| 3% Hydrogen Peroxide | Fisher Scientific | H312P-4 | |
| 25g Needle | BD Biosciences | 305122 | |
| 10ul Hamilton Sharp Microsyringe | Hamilton Co | 20734 | |
| Skin Stapler and Staples | Stoelting Co. | 59020 | |
| Stereotaxic Frame | Stoelting Co. | 51725 | |
| Living Image Software |  Caliper Life Sciences |
||
| D-luciferin | Gold Biotechnology | LUCK-1G | Potassium Salt |
| Xenogen Lumina | Caliper Life Sciences |
References
- Giannini, C., Sarkaria, J. N., Saito, A., Uhm, J. H., Galanis, E., Carlson, B. L., Schroeder, M. A., James, C. D. Patient Tumor EGFR and PDGFRA Gene Amplifications Retained in an Invasive Intracranial Xenograft Model of GBM. Neuro-Oncol. 7, 164-176 (2005).
- Ozawa, T., Wang, J., Hu, L. J., Bollen, A. W., Lamborn, K. R., Deen, D. F. Growth of human glioblastomas as xenografts in the brains of athymic rats. In Vivo. 1, 55-60 (2002).
- Hashizume, R., Ozawa, T., Dinca, E. B., Banerjee, A., Prados, M. D., James, C. D., Gupta, N. A human brainstem glioma xenograft model enabled for bioluminescence imaging. J Neurooncol. , Forthcoming (2009).
- Baia, G. S., Dinca, E. B., Ozawa, T., Kimura, E. T., McDermott, M. W., James, C. D., VandenBerg, S. R., Lal, A. An orthotopic skull base model of malignant meningioma. Brain Pathol. 2, 172-179 (2007).
- Ozawa, T., James, C. D. Human Brain Tumor Cell and Tumor Tissue Transplantation Models. CNS Cancer: Models, Markers, Prognostic Factors, Targets, and Therapeutic Approaches. Van Meir, E. , Humana Press-Springer. New York, NY. 147-162 (2009).
- Sarkaria, J. N., Yang, L., Grogan, P. T., Kitange, G. J., Carlson, B. L., Schroeder, M. A., Galanis, E., Giannini, C., Wu, W., Dinca, E. B., James, C. D. Identification of Molecular Characteristics Correlated with Glioblastoma Sensitivity to EGFR Kinase Inhibition Through Use of an Intracranial Xenograft Test Panel. Mol. Cancer Ther. 6, 1167-1174 (2007).
- Dinca, E. B., Sarkaria, J. N., Schroeder, M. A., Carlson, B. L., Voicu, R., Gupta, N., Berger, M. S., James, C. D. Bioluminescence Monitoring of Intracranial Glioblastoma Xenograft Response to Primary and Salvage Temozolomide Therapy. J. Neurosurg. 107, 610-616 (2007).
- Kaplan, E. L., Meier, P. Non-parametric estimation from incomplete observations. J. Am. Stat. Assoc. 53, 457-481 (1958).
- Peto, R., Peto, J. Asymptotically efficient rank invariant procedures. J. R. Stat. Soc. Ser. A. Stat. Soc. 135, 185-207 (1972).
- Camphausen, K., Purow, B., Sproull, M., Scott, T., Ozawa, T., Deen, D. F., Tofilon, P. J. Influence of in vivo growth on human glioma cell line gene expression: convergent profiles under orthotopic conditions. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.. 102, 8287-8292 (2005).
