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Summary
ここでは、動物由来の医薬品中のトリメチルアミン(TMA)の測定に適したヘッドスペースガスクロマトグラフィー-タンデム四重極質量分析(HS-GC-MS/MS)法について説明します。プロトコルには、サンプルの前処理、ヘッドスペース処理、分析条件、方法論的検証、および動物由来医薬品中のTMAの測定が含まれます。
Abstract
動物由来医薬品は、独特の特徴と顕著な治療効果を有するが、それらのほとんどは明らかな生臭さを有し、その結果、臨床患者のコンプライアンスが悪くなる。トリメチルアミン(TMA)は、動物由来の薬における重要な魚臭成分の1つです。既存の検出方法では、灰汁添加後の急速な酸塩基反応によるヘッドスペースバイアル内の圧力上昇により、TMAがヘッドスペースバイアルから逃げ出し、動物由来医薬品の生臭さの研究が停滞するため、TMAを正確に同定することは困難である。本研究では,酸と灰汁の分離層としてパラフィン層を導入した制御検出法を提案した.TMAの生成速度は、恒温炉加熱によってパラフィン層をゆっくりと液化することによって効果的に制御することができた。この方法は、良好な直線性、精密な実験、および良好な再現性と高感度の回収率を示しました。動物由来医薬品の消臭に関する技術支援を行いました。
Introduction
動物部位由来の製品やその副産物(ここでは動物由来医薬品と呼びます)を利用したヒト疾患の治療がますます注目されています。それらは、癌、心血管疾患、肝硬変、乳房炎、およびその他の疾患の治療において重要な役割を果たし、強力な効果、少量の投与量、および重要かつ特異的な臨床効果の利点を備えています。しかし、動物由来の医薬品は一般に生臭さが顕著であり、これは患者のコンプライアンスに大きく影響し、特に子供にとって不利です1,2。生臭は、主に医薬品に含まれるタンパク質、アミノ酸、脂肪などの物質に由来し、脂肪酸の酸化やアミノ酸の分解などによって分解され、魚臭のあるさまざまな物質が生成されます2,3,4。その中でもトリメチルアミン(TMA)は、腐った動物由来食品や腐った動物由来食品に広く存在する生臭みのある揮発性ガスです5。
これまで、ガスクロマトグラフィー(GC)、液体クロマトグラフィー(LC)、イオンクロマトグラフィー、分光光度法、液体クロマトグラフィー-質量分析(LC-MS)、およびセンサー法は、環境、食品、および尿中のTMAを検出するために一般的に使用されてきました6,7,8,9。GCカラムと注入システムの低汚染性、高感度、再現性、および低い検出限界(0.1-1 mg/kg)を考慮すると、食品および生物学的分析にはヘッドスペースガスクロマトグラフィー-質量分析(HS-GC-MS)法が好まれました8。現在、中国だけが食品中のTMAの国家標準を確立しており、HS-GC-MSはGB5009.179-2016標準10の最初の方法です。そこで、動物由来医薬品中のTMAを検出するために、上記のHS-GC-MS法を選択した。初期の段階で、私たちの研究グループは、食品中のTMAのHS-GC-MS検出基準が、いくつかの動物由来の医薬品の生臭さを検出できることを発見しました。研究の結果11,12と組み合わせると、TMAが動物由来の医薬品における魚臭の一般的な重要な物質であることが証明される可能性があります。しかし、実験結果の再現性が悪く、TMAエスケープや安定性の悪さなどの問題があり、方法論では検証できないことがわかりました。これは、灰汁がヘッドスペースバイアルに注入され、急速な酸塩基反応によりバイアル内の圧力が上昇したため、TMAが注入孔から逃げ出し、TMAの安定した正確な検出が妨げられたことが原因である可能性があります。そこで本研究では、これらの問題に対処するために、改良されたヘッドスペースガスクロマトグラフィー-タンデム四重極質量分析(HS-GC-MS/MS)検出法を提案しました。
プロトコルは、優れた固液相変化材料である固体パラフィンの助けを借りて、前処理中の酸塩基反応物を分離することにより、サンプルの前処理を改善します。パラフィンが恒温炉の温度上昇に伴ってゆっくりと液化するにつれて、TMAも密封されたヘッドスペースバイアル内でゆっくりと放出され、激しく急速な酸塩基反応によって引き起こされる圧力上昇を回避し、安定した正確なTMA検出を保証しました。さらに、GC-MS/MSのヘッドスペース注入と多重反応モニタリング(MRM)モードの組み合わせにより、マトリックスの化学的干渉を効果的に抑制し、結果の信頼性を確保しました。方法論的検証の結果、改善された検出方法の直線性、精度テスト、および回収率が、良好な再現性と高感度で要件を満たすことができることが証明されました。
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Protocol
フェレティマ、ペリプラネタアメリカーナ、ヒルドの医薬品については表1を参照してください。それらは、成都中医薬大学のXu Runchun教授によって、フェレティマアスペルギルム(E.ペリエ)、ペリプラネタアメリカーナL.、ホイットマニアピグラホイットマンの乾燥体として特定されました。
1. 検体抽出
- フェレティマ、ペリプラネタアメリカーナ、ヒルドをハーブグラインダー(材料表を参照)で粉砕し、薬用粉末を2番(ふるい開口部:0.8 mm)および4番(ふるい開口部:0.25 mm)の標準薬剤ふるいにかけ、2つのふるいの間に粉末を集めて必要なサンプル粉末を取得します。
注: フェレティマ は粉砕後にふわふわしているので、その粉末をふるいにかける必要はありません。 - 50 mLのプラスチック遠沈管に1 gの粉末(0.001 gまで正確)を取り、20 mLの5%トリクロロ酢酸(TCA)溶液( 材料表を参照)を加え、高速分散ホモジナイザーで1,000 rmin-1で1 分間ホモジナイズします。
- ホモジナイズ後、1,717 x g で室温で5分間遠心分離し、ガラス漏斗に少量の吸収性綿を加え、上清を50 mLメスフラスコにろ過します。
- 15 mLと10 mLの5%TCA溶液で上記の抽出プロセスを2回繰り返します。ろ液を混ぜ合わせ、5%TCA溶液で50 mLに希釈します。
2. 試薬調製
- 20%水酸化ナトリウム溶液を調製する:20gの水酸化ナトリウムを秤量し、脱イオン水を使用して容量を100mLメスフラスコに固定する。
- 5%TCA溶液を調製:25 gのTCAを秤量し、脱イオン水を使用して500 mLメスフラスコに容量を固定します。
3. TMA標準原液調製
- TMA標準原液を調製:TMA塩酸塩標準試料0.0162gを秤量し、5%TCA液に溶解し、TMA標準原液100 μg/mLの濃度に等しい容量を100 mLに固定します。4°Cで保存してください。
- TMA標準使用溶液を調製する:一定量のTMA標準ストック溶液を取り、5%TCA溶液で段階的に希釈して、0.1 μg/mL、0.5 μg/mL、1 μg/mL、2 μg/mL、5 μg/mL、および10 μg/mL TMA標準溶液を調製します。
4. ヘッドスペース処理のサンプル
- 20 mLのヘッドスペースバイアルで2 mLの水酸化ナトリウム溶液と0.5 gの固体パラフィン(融点:58-60°C)を正確に計量します( 材料の表を参照)。
- ヘッドスペースバイアルを70°Cのオーブンに約30分間入れます。固体パラフィンは完全に溶けます。
- それを取り出し、パラフィンが固まるように室温まで冷まします。固化したパラフィンは水酸化ナトリウムを密封します。
- 各サンプル抽出溶液2 mLを取り、パラフィン層の上に置き、キャップを押して密封します。
- 密封されたヘッドスペースバイアルを機械( 材料表を参照)に置いて測定します。
5. HS-GC-MS/MS 分析条件の設定
- ヘッドスペース条件およびGC-MS条件については、 表2 を参照してください。
- イオン情報については 、表 3 を参照してください。
6.標準曲線描画
- ステップ4.1〜4.3のサンプルヘッドスペース処理を参照して、灰汁とパラフィンのシーリング層を含むヘッドスペースバイアルを準備します。
- 0.1 μg/mL、0.5 μg/mL、1 μg/mL、2 μg/mL、5 μg/mL、および10 μg/mL TMA標準溶液2 mLを20 mLヘッドスペースバイアルに吸引し、キャップを密封して機械で測定します。
7.精密試験
- ステップ4.1〜4.3のサンプルヘッドスペース処理を参照して、灰汁とパラフィンシール層を含むヘッドスペースバイアルを準備します。
- 2 mLの0.1 μg/mL TMA標準溶液を20 mLヘッドスペースバイアルに吸引し、キャップを密封します。製造元の指示に従って、機械で6つの並列テストを実行します( 材料表を参照)。
8.回収率実験
- フェレティマ、ペリプラネタアメリカーナ、ヒルドのバッチを取ります(S02、S05、S07;表1)回収率実験の代表的な医薬品として。
- サンプル粉末(S02、S05、S07)を数バッチ取り、TMAが検出されなくなるまで50°Cのオーブンで72時間焼きます。
- 焼き薬粉末中のTMAの含有量を検出するには、セクション4〜6のサンプル調製方法を参照してください。
- 焼き粉末1 g(0.001 gまで正確)を取り、50 mLのプラスチック遠沈管に入れ、50 μLのTMA標準溶液を加えます。
注:TMA標準溶液の濃度は、100 μg/mL、1000 μg/mL、および10000 μg/mLです。 - 20 mLの5%TCA溶液を加え、1000 rmin-1で1 分間ホモジナイズします。
- 均質化後、1717 x g で5分間遠心分離し、ガラス漏斗に少量の吸収性綿を加え、上清を50 mLメスフラスコにろ過します。
- 15 mLおよび10 mLの5%TCA溶液で上記の抽出プロセスを2回繰り返します。ろ液を混ぜ合わせ、5%TCA溶液で50 mLに希釈します。
9. 検出限界(LOD)と定量限界(LOQ)の決定
- 信号対雑音比(S/N)= 3のときの対応する濃度によってLODを決定します。
- S/N = 10のときの対応する濃度によってLOQを決定します。
10.サンプルTMA含有量の決定
- フェレティマ、ペリプラネタアメリカーナ、ヒルドの微粉末をそれぞれ約1g取り、上記の方法に従ってサンプルを抽出し、機械で測定します。
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Representative Results
このプロトコルの前処理原理と動作の概略図をそれぞれ図1と図2に示します。TMAのピーク時間は2.3分で、ピーク形状がシャープで、他の不純物からの干渉はありませんでした(図3)。TMA濃度を横軸、ピーク面積を縦軸として、0.1-10 μg/mL TMA標準液の直線範囲を測定し、標準曲線を描画した。線形回帰式はy = 2522482x + 24255として得られ、相関係数(R2)= 0.9998であり、良好な線形関係を示した。LOD と LOQ は、それぞれ S/N = 3 と S/N = 10 で計算されました。LODは0.03 mg/kg、LOQは0.11 mg/kgであった。この方法の精度を調べるために、TMA(0.1 μg/mL)の含有量を5.84%の相対標準偏差(RSD)と並行して6回測定し、この方法の良好な精度を証明しました。フェレティマ、ペリプラネタアメリカーナ、ヒルドからのサンプルのグループが、回収実験の代表サンプルとして選択されました(それぞれS02、S05、S07)。これらをハーブ中のTMAを低減するために乾燥によるスパイク回収試験を行ったところ、平均回収率はそれぞれ84.49%、94.66%、85.67%であり、精度は分析要件を満たしていました(表4)。TMAは、フェレティマ、ペリプラネタアメリカーナ、ヒルドのハーブの9つのバッチで検出され、濃度は13.23〜271.63 mg / kgの範囲でした(表5)。このプロトコル法は、良好な方法論的検証結果を有し、明らかな魚臭を有する動物由来薬物中のTMA含有量も検出した。
図1:灰汁-パラフィン抽出溶液の反応原理の模式図。 (1)20 mLのヘッドスペースバイアルに2 mLの水酸化ナトリウム溶液を正確に計量します。(2)0.5 gの固体パラフィンをヘッドスペースバイアルに加えます。(3)水酸化ナトリウム溶液で層状になり、水酸化ナトリウム溶液の上に浮かぶ固体パラフィンを加熱して溶融する。(4)冷却後、パラフィンは固化し、水酸化ナトリウム溶液の上にしっかりと密封します。(5)サンプル抽出液2mLを取り、パラフィン層の上に置き、キャップを押して密封します。(6)密封されたヘッドスペースバイアルを測定のために機械に置きます。恒温オーブンの加熱によりパラフィン層が溶融し、パラフィン層の上下の酸塩基反応物が反応して密閉環境でTMAを生成します。サンプルのヘッドスペース処理は、セクション1〜6で大まかに実行されます。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:サンプル前処理操作の概略図。 (A)灰汁の封印:プロトコルのステップ4.1-4.3。(B)サンプル抽出:プロトコルのセクション1およびステップ4.4。(C)TMA検出:プロトコルのステップ4.5およびセクション5。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:TMAの全イオンクロマトグラム。 1 μg/mL TMA標準溶液のスペクトログラム。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| バッチ | 元 | |
| フェレティマ | S01 | 四川省楽山市 |
| フェレティマ | S02 | 広東省ディアンバイ市 |
| フェレティマ | S03 | 広東省茂明市 |
| ペリプラネタアメリカーナ | S04 | 四川省梁山李族自治州西昌市 |
| ペリプラネタアメリカーナ | S05 | 雲南省大理県美都県 |
| ペリプラネタアメリカーナ | S06 | 安徽省亳州市 |
| ヒルド | S07 | 山東省済寧市威山県 |
| ヒルド | S08 | 江蘇省昆山市 |
| ヒルド | S09 | 山東省済南市莱蕪区 |
表1:動物由来の医薬品情報。
| ヘッドスペースの状態 | |
| サーモスタットオーブンの温度 | 80 °C |
| サンプルbサーモスタットの時間 | 30分 |
| ヘッドスペースニードル温度 | 100 °C |
| サンプルサイズ | 1ミリリットル |
| GC-MS 条件 | |
| クロマトグラフィーカラム | SH 揮発性アミン、 30 メートル× 0.32 ミリメートル× 5 μm |
| カラム温度プログラム | 40 °C (0.5 分) _20 °C/分 _200 °C (5 分) |
| インジェクター温度 | 200 °C |
| キャリアガス制御モード | 一定の線速度 |
| インジェクションモード | スプリットインジェクション |
| 分割比率 | 10:01 |
| カラムフロー | 2ミリリットル/分 |
| サンプルサイズ | 1ミリリットル |
| イオン化モード | ティッカー |
| イオン源温度 | 200 °C |
| GC-MS 界面温度 | 230 °C |
| 検出器電圧 | 同調電圧 +0.6 kV |
| 集録モード情報 | ティッカー |
表2:ヘッドスペースの状態とGC-MS/MSの状態。
| 化合物名 | ティッカー | 保持時間(分) | 定量イオン(m/z) | 西暦 | 基準イオン (m/z) | 西暦 |
| トリメチルアミン | 75-50-3 | 2.308 | 58>42 | 20 | 58>30 | 7 |
表3:TMA化合物情報。
| 見本 | サンプル濃度(ミリグラム/キログラム) | スパイク濃度 (mg/kg) | 測定濃度(mg/kg) | 平均回収率(%) | RSD (%) |
| S02 | 128.99 | 500.00 | 548.50 | 84.49 | 2.12% |
| S05 | 49.08 | 500.00 | 520.93 | 94.66 | 0.96% |
| S07 | 101.36 | 500.00 | 527.07 | 85.67 | 1.87% |
表4:動物由来医薬品におけるTMAの回収率実験の結果。
| 見本 | サンプル濃度(ミリグラム/キログラム) |
| S01 | 88.11 |
| S02 | 137.34 |
| S03 | 18.63 |
| S04 | 19.10 |
| S05 | 40.50 |
| S06 | 13.23 |
| S07 | 271.63 |
| S08 | 69.73 |
| S09 | 67.70 |
表5:動物由来医薬品中のTMA濃度の測定結果。
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Discussion
動物由来の医薬品は、動物の全身、臓器または組織、生理学的または病理学的産物、排泄物または分泌物、および加工製品から得られます。TMAは、動物由来の医薬品に含まれる魚臭の重要な原因です。これは、嗅覚閾値が非常に低く(0.000032 × 10-6 V / V)、強い魚臭13を持つ典型的な悪臭物質です。現在、一般的に使用されているHS-GC-MS法では、動物由来医薬品中のTMAを安定的かつ正確に検出することはできません。
このプロトコルはいくつかの側面で改善されています:(1)TMAはより極性とアルカリ性です。このプロトコルでは、揮発性アミンガスクロマトグラフィー用の特別なカラムがTMAを検出するために選択され、TMA検出の精度と感度が保証されます。(2)GB5009.179-2016のHC-GC-MS法のサンプル調製プロセスでは、高濃度の水酸化ナトリウム溶液を密閉されたヘッドスペースバイアル10に注入します。このとき、酸塩基反応が発生すると、ヘッドスペースバイアル内の圧力が上昇し、TMAの脱出を引き起こし、TMAの不正確な検出につながる可能性があります。このプロトコルは、伝統的な漢方薬における二酸化硫黄残留物の検出方法を参照しました14。サンプルの前処理では、酸塩基反応物を単離するための媒体として固体パラフィンが使用されます。ヘッドスペースバイアルを密封した後、パラフィンは恒温炉の加熱下でゆっくりと溶融し、激しい酸塩基反応を回避し、TMA反応のための良好な気密環境を提供し、TMA検出の安定性と精度を確保します。(3)このプロトコルは、取得にGC-MS/MSのMRMモードを使用し、検出パラメータ(カラム温度プログラムなど)を最適化して、分析効率と精度を確保します。
このプロトコルの操作では、次の点に注意を払う必要があります:(1)適切な量の固体パラフィンワックスを選択する必要があります。パラフィンの投与量が少ないと、密封されていないパラフィン層と酸塩基反応物の即時反応が生じ、密封前にTMAが生成されて逃げます。パラフィンの投与量が多いと、TMAの放出、濃縮、および検出が妨げられる可能性があります。(2)腺はしっかりと締まっていて、シールは無傷でなければなりません。さらに、プロトコルにはいくつかの制限があります。動物由来医薬品中のTMAは内因性であり、乾燥によってきれいに除去することはできません。回収実験には低濃度のTMA塩酸塩標準液を用いたが、効果は不十分であった。したがって、同じ濃度のTMA塩酸塩標準液のみが、このプロトコルにおける回収実験のために選択された。
結論として、このプロトコルは、サンプルの前処理方法と動物由来医薬品中のTMAの正確な検出を提供しました。本法の確立は、動物由来医薬品中のTMA検出法のギャップを埋め、動物由来医薬品中の魚臭物質の研究に技術支援を提供し、動物由来医薬品の研究・開発・応用を促進する上で大きな意義を有する。
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Disclosures
著者は開示するものは何もありません。
Acknowledgments
この研究は、中国国家自然科学財団(82173991)と四川科学技術プログラム(2022YFS0442)からの助成金によってサポートされました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Centrifuge | Beckman Coulter Trading (China) Co. | SSC-2-0213 | |
| Chinese herbal medicine grinder | Zhejiang Yongkang Xi'an Hardware and Pharmaceutical Factory | HX-200K | |
| Convection oven | Sanyo Electric Co., Ltd | MOV-112F | |
| Decapper for 20 mm Aluminum caps | ANPEL Laboratory Technologies (Shanghai) Inc | V1750004 | |
| Electronic balance | Shimadzu Corporation Japan | AUW220D | |
| Gas chromatography mass spectrometry | Shimadzu Corporation Japan | TQ-8050 NX | |
| Headspace Vial | ANPEL Laboratory Technologies (Shanghai) Inc | 25760200 | |
| Homogenizer | Shanghai biaomo Factory | FJ200-SH | |
| Preassembled Cap | ANPEL Laboratory Technologies (Shanghai) Inc | L4150050 | |
| Sample sieve | Zhenxing Sieve Factory | / | |
| SH-Volatile Amine | Chengdu Meimelte Technology Co., Ltd | 227-3626-01 | |
| Sodium hydroxide | Chengdu Chron Chemicals Co., Ltd | 2022101401 | |
| Solid paraffin wax | Shanghai Hualing Kangfu apparatus factory | 20221112 | |
| Trichloroacetic acid | Chengdu Chron Chemicals Co., Ltd | 2022102001 | |
| Trimethylamine hydrochloride | Chengdu Aifa Biotechnology Co., Ltd | AF22022108 | |
| Ultra-pure water system | Sichuan Youpu Ultrapure Technology Co., Ltd | UPR-11-5T |
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Tags
化学、第193号、動物由来医学、トリメチルアミン、生臭、ヘッドスペースガスクロマトグラフィー-タンデム四重極質量分析Erratum
Formal Correction: Erratum: An Improved Technique for Trimethylamine Detection in Animal-Derived Medicine by Headspace Gas Chromatography-Tandem Quadrupole Mass Spectrometry
Posted by JoVE Editors on 11/28/2023.
Citeable Link.
An erratum was issued for: An Improved Technique for Trimethylamine Detection in Animal-Derived Medicine by Headspace Gas Chromatography-Tandem Quadrupole Mass Spectrometry. The Authors section was updated from:
Hui Ye1
Xuemei Liu1
Haozhou Huang2
Lin Huang1
Yang Bao1
Hongyan Ma1
Junzhi Lin3
Xiaoming Bao4
Dingkun Zhang1
Runchun Xu1
1State Key Laboratory of Southwestern Chinese Medicine Resources, Pharmacy School, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine
2Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine
3TCM Regulating Metabolic Diseases Key Laboratory of Sichuan Province, Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine
4Shimadzu (China) Co., Ltd
to:
Hui Ye1
Xuemei Liu1
JiaBao Liao2
Haozhou Huang3
Lin Huang1
Yang Bao1
Hongyan Ma1
Junzhi Lin4
Xiaoming Bao5
Dingkun Zhang1
Runchun Xu1
1State Key Laboratory of Southwestern Chinese Medicine Resources, Pharmacy School, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine
2China Resources Sanjiu Modern Chinese Medicine Pharmaceutical Co., Ltd
3Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine
4TCM Regulating Metabolic Diseases Key Laboratory of Sichuan Province, Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine
5Shimadzu (China) Co., Ltd
