Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

قياسات في الوقت الحقيقي لمعلمات الكالسيوم والانقباض في الخلايا العضلية القلبية المشتقة من الخلايا الجذعية المستحثة بالإنسان

Published: May 26, 2023 doi: 10.3791/65326
Automatic Translation
1,2, 1,2,3, 1,2,3, 4, 4, 1,2, 1,2
1Division of Physiology, Amsterdam UMC, Vrije University, 2Heart Failure & Arrhythmias, Amsterdam Cardiovascular Sciences, 3CytoCypher BV, 4Division of Clinical Pharmacology, Vanderbilt School of Medicine

ERRATUM NOTICE

Summary

هنا ، يتم وصف طريقة راسخة لإجراء قياسات الانقباض والكالسيوم في خلايا عضلة القلب المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان باستخدام منصة قائمة على البصريات. تمكن هذه المنصة الباحثين من دراسة تأثير الطفرات والاستجابة لمختلف المحفزات بطريقة سريعة وقابلة للتكرار.

Abstract

تمثل الخلايا العضلية القلبية المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية (hiPSC-CMs) أداة قوية لدراسة التغيرات بوساطة الطفرة في وظيفة عضلة القلب وتحديد آثار الضغوطات والتدخلات الدوائية. في هذه الدراسة ، ثبت أن هذا النظام القائم على البصريات هو أداة قوية لتقييم المعلمات الوظيفية ل hiPSC-CMs في 2D. باستخدام هذه المنصة ، من الممكن إجراء قياسات مزدوجة في بيئة درجة حرارة محفوظة جيدا على تخطيطات لوحات مختلفة. علاوة على ذلك ، يوفر هذا النظام للباحثين تحليلا فوريا للبيانات.

تصف هذه الورقة طريقة لقياس انقباض hiPSC-CMs غير المعدلة. يتم قياس حركية الانكماش عند 37 درجة مئوية بناء على تغيرات ارتباط البكسل بالنسبة إلى إطار مرجعي تم التقاطه عند الاسترخاء عند تردد أخذ العينات 250 هرتز. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن الحصول على قياسات متزامنة لعابرات الكالسيوم داخل الخلايا عن طريق تحميل الخلية بفلوروفور حساس للكالسيوم ، مثل Fura-2. باستخدام مفتاح فائق ، يمكن إجراء قياسات الكالسيوم النسبية على بقعة إضاءة قطرها 50 ميكرومتر ، بما يتوافق مع منطقة قياسات الانقباض.

Introduction

قصور القلب هو السبب الرئيسي للوفاة في جميع أنحاء العالم. في عام 2019 ، تسببت أمراض القلب والأوعية الدموية في 18.6 مليون حالة وفاة على مستوى العالم ، مما يعكس زيادة بنسبة 17.1٪ خلال العقدالماضي 1. على الرغم من الجهود التي يبذلها الباحثون لتحديد أهداف الأدوية للوقاية من قصور القلب وعلاجه ، لا تزال نتائج المرضى ضعيفة2. يمكن أن يكون الاختلاف في الفيزيولوجيا المرضية للنماذج الحيوانية فيما يتعلق بالبشر أحد العوامل الأساسية في النجاح المحدود لتحسين علاج قصور القلب3. هناك ما يبرر نماذج إضافية شبيهة بالإنسان لنمذجة المرض واختبار سمية وفعالية مركبات الأدوية الجديدة.

تمثل الخلايا العضلية القلبية المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية (hiPSC-CMs) أداة قوية لتحديد الآليات المرضية الخلوية التي تسببها الضغوطات أو نقص التروية أو التمثيل الغذائي المتغير أو المتغيرات الجينية المسببة للأمراض وفعالية وسمية التدخلات الدوائية4. لتحديد التأثيرات على الخصائص الوظيفية ل hiPSC-CMs ، هناك ما يبرر وجود نظام عالي السرعة يقيس الخصائص الانقباضية والانبساطية للانقباضات الخلوية بطريقة غير متحيزة وقابلة للتكرار. هذا الهدف العام للدراسة الحالية هو إثبات أن النظام القائم على البصريات هو أداة قوية لإجراء تحليلات في الوقت الفعلي للمعلمات الوظيفية ل hiPSC-CMs.

حاليا ، هناك منصات متعددة لتقييم انقباض hiPSC-CMs. ومع ذلك ، فإن الأنظمة الحالية إما تقدم قراءة بطيئة ، أو قد يمثل العدد المطلوب من الخلايا تحديا. تعتمد أنظمة قياس الفيديو الخالية من الملصقات 5,6 على التحليل اللاحق لمقاطع الفيديو ، الأمر الذي يتطلب مساحة تخزين كبيرة ويفتقر إلى التعليقات المباشرة أثناء الحصول على الفيديو. وبالإضافة إلى ذلك، يصعب تحقيق استبانة زمنية ومكانية كافية، وقد يؤدي ذلك إلى نقص العينات. قد تتداخل الطرق الأخرى لتحديد خصائص الخلايا العضلية القلبية ، مثل التكرارات العنقودية القصيرة المتباعدة بانتظام (CRISPR) / HiPSC-CMs7 المحررة بواسطة Cas9 مع مراسلي الفلورسنت مع استقرار الجينات للخلايا وتتطلب خبرة مخبرية متخصصة.

للتغلب على القيود المذكورة أعلاه ، تم تطوير نظام قياس فريد قائم على البصريات وتقديمه في هذه الدراسة. تتيح هذه المنصة قياسات الانقباض على hiPSC-CMs غير المعدلة ببساطة عن طريق إعادة طلائها على أي تنسيق لوحة مطلوب ، دون أي قيود في حجم اللوحة. علاوة على ذلك ، تسمح القياسات في الوقت الفعلي بالمراقبة والتحليلات المباشرة للمعلمات الوظيفية ل hiPSC-CMs ، وبالتالي توفر إعدادا تجريبيا لضبط البروتوكولات وتحسينها على الفور. علاوة على ذلك ، يتم تخزين موقع كل قياس ، مما يتيح إجراء قياسات مزدوجة على نفس العينة ، وبالتالي زيادة قوة التجارب.

لإثبات النظام القائم على البصريات ، تم إجراء قياسات الانقباض على خط التحكم hiPSC-CM. تم إنشاء خط التحكم hiPSC هذا من الخلايا الليفية الجلدية لمتبرع ذكر سليم مع النمط النوويالطبيعي 8. تم قياس حركية الانكماش عند 37 درجة مئوية ، بناء على تغيرات ارتباط البكسل بالنسبة إلى إطار مرجعي تم التقاطه أثناء الاسترخاء عند تردد أخذ العينات 250 هرتز. نظرا لأنه لا يمكن دائما تحديد البداية الدقيقة للانكماش بشكل لا لبس فيه ، فقد تم أخذ النقطة الزمنية التي تم فيها الوصول إلى 20٪ من ارتفاع الذروة (الوقت إلى الذروة 20٪) كنقطة انطلاق لقياسات الوقت حتى الذروة. من خلال القيام بذلك ، تم العثور على تباين أقل لهذه المعلمة داخل عينة واحدة. وبالمثل، نظرا لصعوبة تقييم اللحظة الدقيقة التي تعود فيها الإشارة إلى خط الأساس، فقد تم استخدام الوقت المستغرق للوصول إلى 80٪ من العودة إلى خط الأساس من الذروة (الوقت إلى خط الأساس 80٪) لوصف وقت الاسترخاء.

تضمنت قياسات الانقباض الإجمالية ترددات الضرب أثناء الراحة ، والوقت من 20٪ من الذروة إلى الذروة (TP. Con) ، والوقت من ذروة الانكماش إلى 80٪ من خط الأساس (TB. Con80) (الشكل 1 ب). لاختبار تأثير الإجهاد ، تم تحضين الخلايا باستخدام الأيزوبرينالين (ISO). بالإضافة إلى ذلك ، بالتزامن مع قياسات الانقباض ، تم قياس عابري Ca 2+ عن طريق تحميل الخلايا باستخدام إستر Fura-2-acetoxymethyl (Fura-2 AM) بتردد أخذ عينات يبلغ 250 هرتز. تم إجراء قياسات Ratiometric Ca 2+ 9 باستخدام مفتاح فائق على منطقة إضاءة قطرها 50 ميكرومتر ، المقابلة لمنطقة قياسات الانقباض. يتم تصوير بيانات قياس Ca 2+ على أنها الوقت من 20٪ من الذروة إلى الذروة في Ca2+ العابر (TP.Ca) والوقت من الذروة إلى 80٪ من خط الأساس (TB.Ca80) (الشكل 1C). تم استخدام أداة تحليل بيانات سريعة وتلقائية للحصول على متوسط المعلمات الحركية للانقباض والكالسيوم لكل منطقة.

Protocol

1. إعداد وسائط زراعة الخلايا والكواشف

  1. قم بإعداد وسائط hiPSC-CM عن طريق إضافة 1 مل من مكمل B27 (50x) إلى 49 مل من RPMI1640.
  2. قم بإعداد وسط إعادة الطلاء عن طريق إضافة 5 مل أولا من استبدال مصل الضربة القاضية إلى 45 مل من وسائط hiPSC-CM. ثم أضف 22.5 ميكرولتر من مثبط Y-27632 ROCK (تخفيف 1: 2000 ؛ تركيز المخزون: 10 مللي مول) واخلطه جيدا.
  3. قم بإعداد الألواح المطلية بغشاء القاع كما هو موضح أدناه:
    1. قم بإذابة قارورة من الغشاء القاعدي طوال الليل في الثلاجة أو على صندوق ثلج.
    2. قم بتخفيف الغشاء القاعدي بكمية مناسبة من وسط النسر المعدل من Dulbecco / Ham's F12 (DMEM / F12). نظرا لأن كل دفعة من الغشاء القاعدي لها تركيز مختلف ، احسب كمية DMEM / F12 اللازمة للوصول إلى تخفيف 1 مجم / 1 مل. اصنع 0.5 أو 1 مل من القسامات للتخزين عند -20 درجة مئوية.
      ملاحظة: يجب إجراء الخطوة 1.3.2 على الجليد داخل غطاء التدفق.
    3. قم بإذابة حصة 0.5 مل من الغشاء القاعدي وقم بتخفيفها ب 6 مل من DMEM / F12. تخلط جيدا.
    4. قم بتغطية اللوحة عن طريق سحب 250 ميكرولتر من الغشاء القاعدي المخفف / البئر في لوحة 24 بئرا. احسب بناء على مساحة سطح كل بئر لتنسيقات الألواح المختلفة ، على سبيل المثال ، 1 مل / بئر في لوحة 6 آبار.
    5. احتضان اللوحة لمدة 1 ساعة في حاضنة 37 درجة مئوية.
  4. قم بإعداد حصص Fura-2 AM عن طريق إذابة Fura-2 AM في ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) ، وفقا لدليل الشركة المصنعة لإعداد حصص 1 mM. قم بتخزين القسامات في درجة حرارة -20 درجة مئوية.

2. زراعة hiPSC-CMs

  1. قم بإذابة قنينة من hiPSC-CMs في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية. انقل المحتوى المذاب للقارورة إلى أنبوب سعة 15 مل. أضف 10 مل من وسط إعادة الطلاء بطريقة قطرة إلى الخلايا.
  2. أجهزة الطرد المركزي الخلايا لمدة 5 دقائق في 100 × غرام.
  3. قم بإزالة المادة الطافية وأضف 1 مل من وسط إعادة الطلاء. قم بالسحب برفق لأعلى ولأسفل لإعادة تعليق الحبيبات وإزالة أي كتل خلوية.
  4. استخدم مقياس الدم أو عداد الخلايا الآلي لحساب عدد الخلايا.
  5. قم بإزالة الغشاء القاعدي من اللوحة المحتضنة واستبدله بوسط إعادة الطلاء.
  6. قم بطلاء الخلايا بكثافة خلية مناسبة على صفيحة بئر 6/12/24/48/96 مطلية بغشاء قاعدي (على سبيل المثال ، 250000 خلية / بئر في صفيحة 24 بئرا).
    ملاحظة: بالنسبة للتجارب العابرة Ca2+ ، قم بوضع الخلايا على ألواح زجاجية القاع.
  7. استبدل الوسط بوسط استزراع hiPSC-CM في اليوم التالي ثم قم بتحديث الوسط كل يومين باستخدام 0.5 مل / بئر في لوحة 24 بئرا.
  8. قم بإجراء قياسات الانقباض بمجرد تعافي hiPSC-CMs من الذوبان وإعادة الطلاء (3-5 أيام بعد إعادة الطلاء في هذا البروتوكول).
    ملاحظة: في حالة إعادة طلاء الخلايا غير المتكافئة ، من الممكن أن مجموعة من الخلايا ليست على اتصال ببقية الخلايا المعاد طلاؤها وقد تظهر بعض أنماط الضرب غير المنتظمة أو غير المتزامنة. لتجنب عدم التزامن ، ينصح بتوزيع متساو للخلايا وطبقة أحادية متزامنة متصلة جيدا من hiPSC-CMs في كل بئر.

3. قياسات الانقباض

  1. قم بتشغيل نظام القياس القائم على البصريات ومصدر ضوء الصمام الثنائي الباعث للضوء المجهري (LED) والكمبيوتر (انظر جدول المواد).
  2. افتح البرنامج وافتح ملفا جديدا. ضمن ملف في أعلى يمين الشاشة، انقر فوق جديد.
  3. انقر فوق تجميع ، واختر التجارب ، ثم حدد "iPSC + الكالسيوم".
  4. قم بتشغيل جهاز التحكم في المناخ. اضبط درجة الحرارة على 37 درجة مئوية ومستوى CO2 على 5٪.
  5. استبدل وسط الاستزراع hiPSC-CM بمحلول Tyrode (0.5 مل / بئر في لوحة 24 بئر). استبدل غطاء اللوحة بغطاء التحكم في المناخ.
    ملاحظة: إذا كانت هناك حاجة إلى إجراء قياسات عابرة للكالسيوم ، فقم بتحميل الخلايا باستخدام Fura-2 AM ، كما هو موضح في القسم 4.
  6. ضع اللوحة داخل نظام القياس القائم على البصريات بمجرد أن يظهر جهاز التحكم في المناخ أن درجة الحرارة 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: يتم قياس الانكماش باستخدام ظروف برايتفيلد.
  7. انقر فوق فتح مكتشف الخلية أسفل شريط الأدوات وانتظر ظهور شاشة جديدة. في الجزء العلوي الأيسر من الشاشة ، حدد تنسيق اللوحة والبئر.
  8. حدد بئرا واحدا ، واختر منطقة داخل البئر لمراقبة الانكماش والاسترخاء المتزامن ، واضغط على البداية ، وانقر فوق إضافة قياس. حدد مدة القياسات في الإعدادات (10 ثوان لكل منطقة). تجاهل قياسات الانكماش غير المتزامنة على الفور وحدد منطقة جديدة.
    ملاحظة: يمكن رؤية عابري الانقباض في الوقت الفعلي على الشاشة. بالنسبة للانقباضات المتزامنة ، لوحظ وجود عابر مستمر سلس ، بينما بالنسبة للانقباضات غير المتزامنة ، لوحظت قمم إضافية صغيرة.
  9. قم بقياس مساحات متعددة داخل البئر حسب حجم البئر. على سبيل المثال ، لمتابعة هذه الدراسة ، قم بقياس 10 مناطق لكل بئر في لوحة 24 بئرا. في حالة الحاجة إلى قياسات خط الأساس فقط وعدم وجود خطة لاختبار أي مركب ، تابع من الخطوة 3.13.
  10. بعد قياس المناطق داخل البئر ، اضغط على " إكمال" وافتح أداة القياس القائمة على البصريات لإضافة الضغط / المركب إلى البئر (على سبيل المثال ، 500 نانومتر ISO ، مذاب في Tyrode).
  11. اختر وقت الحضانة اعتمادا على مركب الفائدة (2 دقيقة مع ISO في هذا البروتوكول).
  12. انقر فوق القياس التلقائي للسماح لأداة القياس القائمة على البصريات بإجراء قياسات في نفس المناطق التي تم فيها إجراء قياسات خط الأساس ، مما يؤدي إلى قياسات مزدوجة داخل البئر.
  13. اضغط على "اكتمال" بمجرد إجراء جميع القياسات في البئر.
  14. اختر البئر التالي من أعلى يمين الشاشة.
  15. مواصلة القياسات لجميع الآبار المطلوبة.
  16. انقر فوق إيقاف بمجرد قياس جميع الآبار المطلوبة وحفظ الملف.
    ملاحظة: يتم استخدام التحكم في المناخ للحفاظ على استقرار CO2. هذا يسمح بقياس تأثير المركبات / الضغوطات على hiPSC-CMs بطريقة عالية السرعة.

4. قياسات الكالسيوم العابرة

  1. تحضير محلول تيرود 37 درجة مئوية.
  2. قم بإذابة حصص Fura-2 AM في محلول Tyrode بحيث يتم إضافة تركيز نهائي قدره 1 μM Fura-2 AM إلى الخلايا.
    ملاحظة: أثناء استخدام Fura-2 AM، تأكد من إطفاء الأضواء الموجودة في غطاء التدفق لتقليل التعرض للضوء.
  3. نضح الوسط واستبدله بمحلول Tyrode الذي يحتوي على Fura-2 AM.
  4. احتضان لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية في حاضنة أو في نظام القياس القائم على البصريات.
  5. قم بإزالة محلول Tyrode الذي يحتوي على Fura-2 AM ، ثم اغسل 2x بمحلول Tyrode الطازج. أخيرا ، احتضان الخلايا في محلول Tyrode لمدة 5 دقائق أخرى عند 37 درجة مئوية للسماح بإزالة أسترة Fura-2 AM.
  6. ضع اللوحة داخل نظام القياس القائم على البصريات وابدأ القياسات ، كما هو موضح في القسم 3.
    ملاحظة: في الخطوة 4.6. من خلال بدء القياسات في وقت واحد مع قياسات الانكماش ، يتم تسجيل عابر الكالسيوم النسبي: الإثارة عند 340 نانومتر و 385 نانومتر في بقعة 100 ميكرومتر ؛ الانبعاثات التي تم جمعها عند 510 ± 40 نانومتر. بالإضافة إلى آثار الانقباض ، ستظهر عابرات الكالسيوم في الوقت الفعلي على الشاشة.

5. تحليل البيانات

  1. لتحليل البيانات، انقر فوق CytoSolver على سطح المكتب.
  2. انقر فوق استيراد وحدد الملف (الملفات) المراد تحليله.
  3. بعد إجراء البرنامج للتحليل ، لاحظ العابرين المقبولين (الأزرق) والمرفوضين (الأحمر) الذين يظهرون على الشاشة (الشكل 1 أ).
    ملاحظة: هنا ، تم استخدام معايير الرفض الافتراضية التالية ، المحددة بنسبة الإشارة إلى الضوضاء (SNR) وجودة الملاءمة (R 2): R 2 > 0.9 و SNR > 4 للعابرين الانكماشيين ، و R2 > 0.5 و SNR > 3 لعابري الكالسيوم. يمكن تعديل معايير الرفض هذه من قبل المستخدم اعتمادا على جودة القياسات وجودة الخلايا والنتيجة الأولية للباحث. على سبيل المثال ، إذا كان اهتمام الباحث هو حركية الاسترخاء بشكل أساسي ، فيمكن تخفيض المعايير لمتغيرات الوقت إلى الذروة. إذا تم الحصول على عابرات الكالسيوم القوية جدا ، فقد يتعين زيادة نسبة الإشارة إلى الضوضاء لاستبعاد البيانات الأكثر ضوضاء.
  4. انقر فوق تصدير وحدد متوسط البيانات العابرة. افحص البيانات التي تم تحليلها والمقدمة في جدول بيانات.
  5. قم بإيقاف تشغيل الكمبيوتر وجميع الأدوات الأخرى.

Representative Results

باتباع هذا البروتوكول ، تم إجراء قياسات الانقباض ، وعابرات Ca2+ ، والاستجابة لمركب في hiPSC-CMs. باستخدام نظام القياس القائم على البصريات هذا ، يمكن ببساطة إعادة طلاء hiPSC-CMs على اللوحات المطلوبة ، ويمكن إجراء قياسات الانقباض. يتم قياس الانقباض في منطقة اهتمام 100 ميكرومتر × 100 ميكرومتر (ROI) بمعدل 250 إطارا في الثانية عن طريق حساب ارتباط البكسل بالنسبة إلى إطار مرجعي. يتم اكتشاف الإطار المرجعي تلقائيا بواسطة النظام عند نهاية الانبساط. بالتزامن مع قياسات الانكماش ، يتم تسجيل عابر الكالسيوم النسبي.

في هذه الدراسة ، تم استخدام ثلاث جولات مختلفة من التمايز كثلاث نسخ بيولوجية. لكل دفعة من التمايز ، تم قياس ثلاثة آبار كنسخ تقنية مكررة. تم إجراء هذه الدراسة باستخدام 24 صفيحة بئر ، وتم قياس 10 مناطق داخل كل بئر. بعد القياسات ، تم استخدام برنامج CytoSolver لتحليل البيانات على الفور. تم الإبلاغ عن المعلمات التالية: تردد الضرب أثناء الراحة ، TP. يخدع ، والسل. Con80 من التحكم hiPSC-CMs (الشكل 2A-C). لتصور تباين البيانات لكل معلمة مذكورة ، يتم عرض القياسات داخل كل بئر ومتوسط قيم ثلاثة آبار لكل جولة من التمايز كقطع أرض فائقة10. لتقييم تباين البيانات بشكل أفضل لكل جولة من جولات التمايز وبين الجولات الثلاث ، تم حساب معامل التباين (الشكل 2D) لكل معلمة. كما هو موضح في الشكل 2D ، تقع قيم النسخ المتماثلة التقنية المقابلة لتكرار بيولوجي واحد ضمن نطاق قريب جدا من بعضها البعض (أي معامل تباين منخفض) ، مما يوضح متانة هذه الطريقة.

هذا التطبيق مناسب تماما لاختبار آثار المخدرات. هنا ، تم اختبار تأثير 500 nM ISO ، وهو ناهض مستقبلات β الأدرينالية غير الانتقائي ، على انقباض التحكم hiPSC-CMs. من المعروف أن هذا المركب يزيد من معدل ضربات القلب ويمارس تأثيرا إيجابيا لوسيتروبيك. كما هو موضح في الشكل 3 أ ، زادت ISO بشكل كبير من تردد الضرب في جميع الآبار. زادت ISO أيضا من الحركية ، وهو ما يتضح في انخفاض TP. يخدع والسل. Con80 (الشكل 3 ب ، ج). بشكل عام ، عند الحضانة مع ISO ، زاد تواتر الضرب بشكل كبير في جميع الآبار ، إلى جانب تقليل وقت الانكماش والاسترخاء ، مما يشير إلى أن الاستجابة المتوقعة لهذا المركب تم تسجيلها بواسطة هذه المنصة.

بالتوازي مع قياسات الانقباض ، تم إجراء قياسات الكالسيوم أيضا. بنفس طريقة بيانات الانقباض (الشكل 2) ، يتم تصوير بيانات قياس الكالسيوم الخاصة ب hiPSC-CMs في الشكل 4. TB.Ca 80 أبطأ بكثير مما هو عليه في خلايا عضلة القلب المعزولة للفئران أو الفئران ، وهو ما يفسره جزئيا الاختلافات في الأنواع ومعدل ضربات القلب11 ، وكذلك من خلال معالجة الكالسيوم غير الناضجة في hiPSC-CMs بسبب انخفاض ديناميكيات الكالسيوم داخل الشبكة الساركوبلازمية وانخفاض التعبير عن بروتينات التعامل مع الكالسيوم مقارنة بالخلايا الأولية12. على غرار بيانات الانقباض ، تم حساب معامل التباين لقياسات الكالسيوم ، ويظهر تباينا منخفضا داخل النسخ المتماثلة التقنية والبيولوجية (الشكل 4C).

Figure 1
الشكل 1: الاستخدام الفوري لأداة التحليل العابر CytoSolver بعد التجربة لتحليل البيانات. (أ) مثال على العابرين المقبولين (كلها باللون الأزرق) لمنطقة واحدة مقاسة داخل بئر. تصور اللوحة A1 العابرين المقلصين. تمثل اللوحة A2 عابرات الكالسيوم. (ب) متوسط انقباض عابر تم الحصول عليه من القياسات في ثلاثة آبار لدورة واحدة من التمايز. من كل عابر واحد أو متوسط ، بيانات من نقاط زمنية مختلفة من الوقت إلى الذروة (TP. يخدع) والوقت إلى خط الأساس (TB. يخدع) من انقباض عابر يمكن استخراجها. نظرا لأنه لا يمكن دائما تحديد البداية الدقيقة للانكماش بشكل لا لبس فيه ، يتم أخذ الوقت حتى الذروة بنسبة 20٪ كنقطة انطلاق لقياسات الوقت حتى الذروة. وبالمثل ، من الصعب تقييم اللحظة الدقيقة التي تعود فيها الإشارة إلى خط الأساس. لذلك ، يتم استخدام الوقت حتى خط الأساس 80٪ لوصف وقت الاسترخاء. هنا ، TP. يخدع (الوقت إلى الذروة - الوقت إلى الذروة 20 ٪) والسل. يتم استخدام Con 80 (الوقت حتى خط الأساس80٪ - وقت الذروة). (ج) متوسط بيانات الكالسيوم العابرة التي تم الحصول عليها من القياسات في ثلاثة آبار لجولة واحدة من التمايز. من كل عابر كالسيوم مفرد أو متوسط ، يمكن استخراج البيانات من نقاط زمنية مختلفة إلى الذروة (TP.Ca) والوقت إلى خط الأساس (TB.Ca) من عابرات الكالسيوم. بالنسبة لقياسات الوقت إلى الذروة ، تكون نقطة البداية هي الوقت حتى الذروة بنسبة 20٪ ، وبالنسبة للوقت حتى خط الأساس ، فإن نقطة النهاية هي الوقت حتى خط الأساس 80٪. في هذه الدراسة ، تم استخدام TP.Ca (الوقت إلى الذروة - الوقت إلى الذروة 20٪) و TB.Ca 80 (الوقت إلى خط الأساس 80٪ - الوقت إلى الذروة). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: قياسات انقباض خط الأساس التي أجريت على ثلاث جولات مختلفة من التمايز. ثلاثة مكررات بيولوجية وثلاثة آبار لكل جولة من جولات التمايز (أي ثلاثة مكررات تقنية). تمثل ثلاثة رموز رئيسية لكل جولة من التمايز متوسط قيمة المساحات المقاسة (رموز الخلفية بألوان باهتة) داخل كل بئر. يتم عرض البيانات كمتوسط ± SEM. يتم تمثيل البيانات المتعلقة بتردد الضرب أثناء الراحة بالهرتز ، وبالنسبة ل TP. يخدع والسل. Con80 ، البيانات في ثوان. (أ) تكرار الضرب أثناء الراحة. (ب) الوقت اللازم للوصول إلى الذروة (TP. يخدع). (ج) الوقت حتى خط الأساس 80٪ (السل. Con80). (د) لتقييم التباين بين البيانات التي تم الحصول عليها في كل جولة وبين جميع جولات التمايز الثلاث ، تم حساب معامل نسبة التباين باستخدام متوسط قيم كل بئر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: قياسات الانقباض عند خط الأساس (-) وبعد الحضانة باستخدام ISO (+) على ثلاثة آبار من ثلاث جولات من التمايز. (أ) تردد الضرب أثناء الراحة (-) وتردد الضرب بعد الحضانة باستخدام 500 نانومتر ISO (+). (ب) الوقت اللازم للوصول إلى الذروة (TP. Con) القياسات عند خط الأساس وبعد الحضانة مع ISO. (ج) الوقت حتى خط الأساس 80٪ (السل. Con80) القياسات عند خط الأساس وبعد الحضانة باستخدام ISO. لتقييم تأثير ISO على معلمات الانقباض ، تم إجراء Anova ثنائي الاتجاه مع تصحيح Bonferroni. يتم عرض البيانات كمتوسط ± SEM. يتم تمثيل البيانات المتعلقة بتردد الضرب أثناء الراحة بالهرتز ، وبالنسبة ل TP. يخدع والسل. Con80 ، يتم تمثيل البيانات بالثواني. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: قياسات الكالسيوم العابرة الأساسية التي أجريت على ثلاثة آبار من ثلاث جولات من التمايز . (أ) الوقت اللازم للوصول إلى الذروة (TP.Ca) و (ب) الوقت حتى خط الأساس 80٪ (TB.Ca 80) من عابرات الكالسيوم. يتم عرض البيانات كمتوسط ± SEM. يتم تمثيل TP.Ca وTB.Ca 80 بيانات بالثواني. (ج) لتقييم التباين بين البيانات التي تم الحصول عليها في كل جولة وبين جميع جولات التمايز الثلاث ، تم حساب معامل نسبة التباين باستخدام متوسط قيمة كل بئر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

في هذه الدراسة ، تم وصف طريقة لإجراء قياسات الانقباض والكالسيوم العابرة على hiPSC-CMs ودراسة تأثير الضغوطات / الأدوية على هذه الخلايا. تم إجراء قياسات الانقباض وقياسات الكالسيوم النسبية والاستجابة ل ISO على ثلاث جولات مختلفة من التمايز كتكرارات بيولوجية. لكل نسخة بيولوجية ، تم إجراء قياسات على ثلاثة آبار أثناء تكرار التقنية. كان سبب إجراء القياسات بهذه الطريقة هو ضمان إمكانية تقييم التباين البيولوجي والتباين التقني للعينة والمنصة. بصرف النظر عن النظر في العدد المناسب من النسخ البيولوجية والتقنية ، يمكن أن تلعب حالة استزراع hiPSC-CM دورا مهما في تحقيق نتائج ثابتة وقوية. من المهم أن تكون متسقة مع المعايير ، مثل عمر hiPSC-CMs ، وتكوين الوسط ، وظروف إعادة الطلاء ، ووقت حضانة المركب أثناء القياسات. في هذه الدراسة ، استغرق الأمر في المتوسط 568 ± 24 ثانية لقياس 11 منطقة مرتين لمدة 10 ثوان في بئر واحدة. يتضمن ذلك وقت حضانة ISO من 79 ± 11 ثانية. هذا ينخفض إلى ما يقرب من 10 دقائق لكل بئر ، والتي ينبغي أن تمكن الباحثين من قياس لوحة كاملة من 24 بئرا في ~ 4 ساعات. يتم استخدام التحكم في المناخ للحفاظ على استقرار CO2. هذا يسمح بقياس تأثير المركبات / الضغوطات على hiPSC-CMs بطريقة عالية السرعة.

لقياس وظيفة انقباض iPSC-CMs ، هناك العديد من الأنظمة الحالية التي تعتمد على علم البصرياتالوراثي 13 أو الفحص المجهري القائم على الفيديوالخالي من الملصقات 5,6. أنظمة علم البصريات الوراثية معقدة للغاية وتتطلب تقنيات خاصة للحصول على بيانات الكهروفيزيائية و / أو الانقباض. تعتمد الأنظمة الأخرى على التحليل اللاحق لمقاطع الفيديو ، الأمر الذي يتطلب مساحة تخزين كبيرة ويفتقر إلى التعليقات المباشرة أثناء الحصول على الفيديو. وبالإضافة إلى ذلك، يصعب تحقيق استبانة زمنية ومكانية كافية، مما قد يؤدي إلى نقص العينات. وبالمثل ، فإن HIPSC-CMs المحررة من CRISPR / CAS-9 مع مراسليالفلورسنت 7 قد تحدث تأثيرات غير مرغوب فيها على سلوك خلايا عضلة القلب. يعد استخدام الأصباغ الفلورية لقياسات استرخاء الانكماش نهجا أنيقا أيضا ، ولكنه يحد من إجراء التجارب على نفس العينة على مدى فترة أطول14.

ومع ذلك ، يمكن استخدام منصة القياس القائمة على البصريات هذه لقياس أوقات الانكماش والاسترخاء دون استخدام أي صبغة فلورية أو طرق غازية. ومع ذلك ، نظرا لأن ارتباط البكسل لا يوفر معلومات مكانية ، فلا يمكن استخدام هذه الطريقة لقياس قوة الانكماش ، بل يمكنها فقط اكتشاف التغيرات في سرعة الانكماش والاسترخاء بشكل موثوق. يتم التحكم في درجة حرارة نظام القياس المقدم ويمكنه الحصول على بيانات الكالسيوم والانقباض في الوقت الفعلي بدقة >200 إطار في الثانية. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تخزين موقع كل قياس ، مما يتيح القياسات المزدوجة ، وبالتالي زيادة قوة التجارب. علاوة على ذلك ، توفر هذه المنصة للباحثين القدرة على تخزين البيانات وتحليلها على الفور بعد التجربة. بشكل عام ، يظهر نظام القياس القائم على البصريات هذا أنه طريقة واعدة لدراسة آليات العلاج الخلوي ، ويمكنه تقييم تأثير المركبات على وظائف hiPSC-CMs ، ويمكن أن يكون مفيدا في العملية قبل السريرية في فحص الأدوية.

Disclosures

EM هو موظف في CytoCypher BV. MH هو الرئيس التنفيذي لشركة CytoCypher BV. يعلن المؤلفون الباقون أن البحث قد أجري في غياب أي علاقات تجارية أو مالية يمكن تفسيرها على أنها تضارب محتمل في المصالح.

Acknowledgments

تم تمويل هذا البحث جزئيا من خلال منحة Eurostars Estars2 113937 CARDIOMYO (EM & DK) ، ومنحة NWO-VICI 91818602 (JV).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
µ-Plate 24 Well Black ID 14 mm ibidi 82421
B-27 Supplement (50x) Thermo Fisher 17504044
CytoSolver transient analysis tool CytoCypher A fast automatic data analysis tool
DMEM/F-12 Thermo Fisher 11320033
Fura-2, AM Thermo Fisher F1221
Isoprenaline hydrochloride Merck 15627
KnockOut™ Serum Replacement Thermo Fisher 10828010
Matrigel Merck CLS3542C Basement membrane
MultiCell CytoCypher with Nikon 20x Super Fluor objective and 730 nm LED light source and Ionwizard software CytoCypher Optics-based measurement system
ROCK inhibitor Y-27632 Tocris 1254
RPMI 1640 Thermo Fisher 11875119
Tyrode Self-made solution with final concentration of the following components: NaCl 134 mM, KCl 5 mM, Hepes 12 mM, MgSO4 1.2 mM, NaH2PO4 H2O 1.2 mM, Glucose 11 mM, Sodium Pyrovate 5 mM, 1 mM CaCl2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tsao, C. W., et al. Heart disease and stroke statistics-2022 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 145 (8), e153 (2022).
  2. Ghionzoli, N., et al. Current and emerging drug targets in heart failure treatment. Heart Failure Reviews. 27 (4), 1119-1136 (2022).
  3. Criscione, J., et al. Heart-on-a-chip platforms and biosensor integration for disease modeling and phenotypic drug screening. Biosensors and Bioelectronics. 220, 114840 (2023).
  4. vander Velden, J., et al. Animal models and animal-free innovations for cardiovascular research: current status and routes to be explored. Consensus document of the ESC Working Group on Myocardial Function and the ESC Working Group on Cellular Biology of the Heart. Cardiovascular Research. 118 (15), 3016-3051 (2022).
  5. Maddah, M., et al. A non-invasive platform for functional characterization of stem-cell-derived cardiomyocytes with applications in cardiotoxicity testing. Stem Cell Reports. 4 (4), 621-631 (2015).
  6. Sala, L., et al. MUSCLEMOTION: A versatile open software tool to quantify cardiomyocyte and cardiac muscle contraction in vitro and in vivo. Circulation Research. 122 (3), e5-e16 (2018).
  7. Sharma, A., et al. CRISPR/Cas9-mediated fluorescent tagging of endogenous proteins in human pluripotent stem cells. Current Protocols in Human Genetics. 96 (1), 1-20 (2018).
  8. Wang, L., et al. Hypertrophic cardiomyopathy-linked mutation in troponin T causes myofibrillar disarray and pro-arrhythmic action potential changes in human iPSC cardiomyocytes. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 114, 320-327 (2018).
  9. Luo, X., et al. IP3R-mediated compensatory mechanism for calcium handling in human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes with cardiac ryanodine receptor deficiency. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 772 (2020).
  10. Lord, S. J., Velle, K. B., Mullins, R. D., Fritz-Laylin, L. K. SuperPlots: communicating reproducibility and variability in cell biology. The Journal of Cellular Biology. 219 (6), e202001064 (2020).
  11. Milani-Nejad, N., Janssen, P. M. L. Small and large animal models in cardiac contraction research: advantages and disadvantages. Pharmacology and Therapeutics. 141 (3), 235-249 (2014).
  12. Karbassi, E., et al. Cardiomyocyte maturation: advances in knowledge and implications for regenerative medicine. Nature Reviews Cardiology. 17 (6), 341-359 (2020).
  13. Klimas, A., Ortiz, G., Boggess, S. C., Miller, E. W., Entcheva, E. Multimodal on-axis platform for all-optical electrophysiology with near-infrared probes in human stem-cell-derived cardiomyocytes. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 154, 62-70 (2020).
  14. van Meer, B. J., et al. Simultaneous measurement of excitation-contraction coupling parameters identifies mechanisms underlying contractile responses of hiPSC-derived cardiomyocytes. Nature Communications. 10 (1), 4325 (2019).

Tags

علم الأحياء، العدد 195،

Erratum

Formal Correction: Erratum: Real-Time Measurements of Calcium and Contractility Parameters in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes
Posted by JoVE Editors on 12/13/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Real-Time Measurements of Calcium and Contractility Parameters in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. The Authors section was updated from:

Rafeeh Dinani1,2
Emmy Manders1,2,3
Michiel Helmes1,2,3
Lili Wang4
Bjorn Knollmann4
Diederik W. D. Kuster1,2
Jolanda van der Velden1,2
1Division of Physiology, Amsterdam UMC, Vrije University
2Heart Failure & Arrhythmias, Amsterdam Cardiovascular Sciences
3CytoCypher BV
4Division of Clinical Pharmacology, Vanderbilt School of Medicine

to:

Rafeeh Dinani1,2
Emmy Manders1,2,3
Michiel Helmes1,2,3
Lili Wang4
Bjorn C. Knollmann4
Diederik W. D. Kuster1,2
Jolanda van der Velden1,2
1Division of Physiology, Amsterdam UMC, Vrije University
2Heart Failure & Arrhythmias, Amsterdam Cardiovascular Sciences
3CytoCypher BV
4Division of Clinical Pharmacology, Vanderbilt School of Medicine

قياسات في الوقت الحقيقي لمعلمات الكالسيوم والانقباض في الخلايا العضلية القلبية المشتقة من الخلايا الجذعية المستحثة بالإنسان
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dinani, R., Manders, E., Helmes, M., … More

Dinani, R., Manders, E., Helmes, M., Wang, L., Knollmann, B. C., Kuster, D. W. D., van der Velden, J. Real-Time Measurements of Calcium and Contractility Parameters in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. J. Vis. Exp. (195), e65326, doi:10.3791/65326 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter