Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Sanntidsmålinger av kalsium- og kontraktilitetsparametere i humane induserte pluripotente stamcelleavledede kardiomyocytter

Published: May 26, 2023 doi: 10.3791/65326
Automatic Translation
1,2, 1,2,3, 1,2,3, 4, 4, 1,2, 1,2
1Division of Physiology, Amsterdam UMC, Vrije University, 2Heart Failure & Arrhythmias, Amsterdam Cardiovascular Sciences, 3CytoCypher BV, 4Division of Clinical Pharmacology, Vanderbilt School of Medicine

ERRATUM NOTICE

Summary

Her beskrives en etablert metode for å utføre kontraktilitets- og kalsiummålinger i humane induserte pluripotente stamcellederiverte kardiomyocytter ved bruk av en optikkbasert plattform. Denne plattformen gjør det mulig for forskere å studere effekten av mutasjoner og responsen på ulike stimuli på en rask og reproduserbar måte.

Abstract

Humane induserte pluripotente stamcelleavledede kardiomyocytter (hiPSC-CMs) representerer et kraftig verktøy for å studere mutasjonsmedierte endringer i kardiomyocyttfunksjonen og definere effekten av stressorer og legemiddelintervensjoner. I denne studien er det demonstrert at dette optikkbaserte systemet er et kraftig verktøy for å vurdere funksjonelle parametere for hiPSC-CM i 2D. Ved å bruke denne plattformen er det mulig å utføre parede målinger i et godt bevart temperaturmiljø på forskjellige plateoppsett. Videre gir dette systemet forskere øyeblikkelig dataanalyse.

Denne artikkelen beskriver en metode for å måle kontraktiliteten til umodifiserte hiPSC-CMer. Kontraksjonskinetikk måles ved 37 °C basert på pikselkorrelasjonsendringer i forhold til et referansebilde tatt ved relaksasjon ved en samplingsfrekvens på 250 Hz. I tillegg kan samtidige målinger av intracellulære kalsiumtransienter oppnås ved å laste cellen med en kalsiumfølsom fluorofor, slik som Fura-2. Ved hjelp av en hyperbryter kan ratiometriske kalsiummålinger utføres på et 50 μm diameter belysningspunkt, tilsvarende området for kontraktilitetsmålingene.

Introduction

Hjertesvikt er den ledende dødsårsaken over hele verden. I 2019 forårsaket hjerte- og karsykdommer 18,6 millioner dødsfall globalt, noe som gjenspeiler en økning på 17,1% det siste tiåret1. Til tross for forskernes innsats for å identifisere legemiddelmål for å forebygge og kurere hjertesvikt, er pasientresultatene fortsatt dårlige2. Forskjellen i patofysiologien til dyremodeller med hensyn til mennesker kan være en av de underliggende faktorene i den begrensede suksessen for optimalisering av hjertesviktbehandling3. Ytterligere menneskelignende modeller er berettiget til å modellere sykdom og teste toksisiteten og effektiviteten av nye legemiddelforbindelser.

Humane induserte pluripotente stamcelleavledede kardiomyocytter (hiPSC-CMs) representerer et kraftig verktøy for å definere cellulære patomekanismer indusert av stressorer, iskemi, endret metabolisme eller patogene genvarianter, og effektiviteten og toksisiteten av legemiddelintervensjoner4. For å definere effekter på de funksjonelle egenskapene til hiPSC-CM, er et høyhastighetssystem som måler de systoliske og diastoliske egenskapene til cellulære sammentrekninger på en objektiv og reproduserbar måte, berettiget. Dette overordnede målet med den nåværende studien er å demonstrere at et optikkbasert system er et kraftig verktøy for å utføre sanntidsanalyser av de funksjonelle parametrene til hiPSC-CMs.

For tiden er det flere plattformer for å evaluere kontraktiliteten til hiPSC-CMs. Imidlertid tilbyr nåværende systemer enten en langsom avlesning, eller det nødvendige antall celler kan være en utfordring. Etikettfrie videomålingssystemer5,6 er avhengige av post-hoc-analyse av videoer, noe som krever mye lagringsplass og mangler direkte tilbakemelding under videoopptak. I tillegg er tilstrekkelig tidsmessig og romlig oppløsning vanskelig å oppnå, og kan føre til undersampling. Andre metoder for å bestemme kardiomyocytegenskaper, for eksempel grupperte regelmessig interspaced korte palindromiske repetisjoner (CRISPR) / Cas9-redigerte hiPSC-CMs7 med fluorescerende reportere, kan forstyrre genstabiliteten til cellene og kreve spesialisert laboratoriekompetanse.

For å overvinne begrensningene nevnt ovenfor, ble et unikt optikkbasert målesystem utviklet og introdusert i denne studien. Denne plattformen muliggjør kontraktilitetsmålinger på umodifiserte hiPSC-CM-er ved ganske enkelt å replatere dem på et hvilket som helst nødvendig plateformat, uten noen begrensning i platestørrelse. Videre tillater sanntidsmålinger direkte observasjon og analyser av de funksjonelle parametrene til hiPSC-CM, og gir dermed en eksperimentell innstilling for å umiddelbart justere og optimalisere protokoller. Videre lagres plasseringen av hver måling, noe som muliggjør parrede målinger på samme prøve, og dermed øker kraften i forsøkene.

For å demonstrere det optikkbaserte systemet ble kontraktilitetsmålinger utført på en kontrollhiPSC-CM-linje. Denne kontrollhisc-linjen ble generert fra dermal fibroblast av en sunn mannlig donor med en normal karyotype8. Kontraksjonskinetikk ble målt ved 37 °C, basert på pikselkorrelasjonsendringer i forhold til et referansebilde tatt under relaksasjon med 250 Hz samplingsfrekvens. Siden den nøyaktige starten på sammentrekningen ikke alltid kan bestemmes entydig, ble tidspunktet da 20% av topphøyden ble nådd (tid til topp 20%) tatt som utgangspunkt for målinger av tid til topp. Ved å gjøre dette ble det funnet mindre variabilitet for denne parameteren i en prøve. På samme måte, ettersom det nøyaktige tidspunktet signalet returnerer til baseline er vanskelig å vurdere, ble tiden det tok å nå 80 % av returen til baseline fra topp (tid til baseline 80 %) brukt til å beskrive relaksasjonstiden.

Samlede kontraktilitetsmålinger inkluderte hvilende slagfrekvenser, tiden fra 20% peak til peak contraction (TP. Con), og tiden fra maksimal sammentrekning til 80 % av baseline (TB. Con80) (figur 1B). For å teste effekten av en stressor ble cellene inkubert med isoprenaline (ISO). I tillegg, sammenfallende med kontraktilitetsmålinger, ble Ca 2+ transienter målt ved å laste cellene med Fura-2-acetoksymetylester (Fura-2 AM) med en samplingsfrekvens på 250 Hz. Ratiometriske Ca2+ målinger9 ved hjelp av en hyperbryter ble gjort på et 50 μm diameter belysningsområde, tilsvarende arealet av kontraktilitetsmålingene. Ca 2+ måledata er vist som tid fra 20 % topp til topp i Ca2+ forbigående (TP.Ca) og tid fra topp til 80 % av basislinjen (TB.Ca80) (figur 1C). Et raskt, automatisk dataanalyseverktøy ble brukt for å gi gjennomsnittlige kontraktile og kalsiumkinetiske parametere for hvert område.

Protocol

1. Fremstilling av cellekulturmedier og reagenser

  1. Forbered hiPSC-CM-medier ved å tilsette 1 ml B27-tilskudd (50x) til 49 ml RPMI1640.
  2. Forbered replatingmediet ved først å tilsette 5 ml knockout serumerstatning til 45 ml hiPSC-CM-medier. Deretter tilsettes 22,5 μL Y-27632 ROCK-hemmer (1:2000 fortynning; stamkonsentrasjon: 10 mM) og blandes godt.
  3. Forbered kjellermembranbelagte plater som beskrevet nedenfor:
    1. Tine et hetteglass med kjellermembran over natten i kjøleskapet eller på en isboks.
    2. Fortynn kjellermembranen med en passende mengde Dulbeccos modifiserte Eagle's medium/Ham's F12 (DMEM/F12). Siden hver batch av kjellermembran har en annen konsentrasjon, beregner du mengden DMEM / F12 som trengs for å nå en 1 mg / 1 ml fortynning. Lag 0,5 eller 1 ml alikoter til oppbevaring ved -20 °C.
      MERK: Trinn 1.3.2 må gjøres på is inne i en flythette.
    3. Tine 0,5 ml alikot av kjellermembran og fortynn den med 6 ml DMEM / F12. Bland godt.
    4. Belegg platen med pipettering av 250 μL fortynnet kjellermembran/brønn i en 24-brønnsplate. Beregn basert på overflaten av hver brønn for forskjellige plateformater, for eksempel 1 ml / brønn i en 6-brønns plate.
    5. Inkuber platen i 1 time i en 37 °C inkubator.
  4. Forbered Fura-2 AM-alikoter ved å oppløse Fura-2 AM i dimetylsulfoksid (DMSO), i henhold til produsentens håndbok for å forberede 1 mM alikoter. Oppbevar alikotene ved -20 °C.

2. Dyrking av hiPSC-CMs

  1. Tine et hetteglass med hisc-CM i et vannbad på 37 °C. Overfør det tinte innholdet i hetteglasset til et 15 ml rør. Tilsett 10 ml av replateringsmediet på en dråpevis måte til cellene.
  2. Sentrifuge cellene i 5 minutter ved 100 × g.
  3. Fjern supernatanten og tilsett 1 ml replateringsmedium. Piper forsiktig opp og ned for å resuspendere pelleten og fjerne eventuelle celleklumper.
  4. Bruk et hemocytometer eller en automatisert celleteller for å telle antall celler.
  5. Fjern kjellermembranen fra den inkuberte platen og erstatt den med replatingmediet.
  6. Plate cellene med en passende celletetthet på en 6/12/24/48/96-brønnplate belagt med kjellermembran (f.eks. 250.000 celler / brønn i en 24-brønnplate).
    MERK: For Ca2+ forbigående eksperimenter, plate cellene på glassbunnplater.
  7. Bytt ut mediet med hiPSC-CM dyrkningsmedium neste dag og oppdater deretter mediet annenhver dag med 0,5 ml / brønn i en 24-brønnsplate.
  8. Utfør kontraktilitetsmålingene når hiPSC-CMene har kommet seg etter tining og replating (3-5 dager etter replating i denne protokollen).
    MERK: Ved ujevn cellereplating er det mulig at en gruppe celler ikke er i kontakt med resten av de replaterte cellene og kan vise noe uregelmessig eller ikke-synkronisert slagmønster. For å unngå asynkroni anbefales det å ha en jevn fordeling av celler og et synkronisert, godt tilkoblet monolag av hiPSC-CM i hver brønn.

3. Kontraktilitetsmålinger

  1. Slå på det optikkbaserte målesystemet, lysdioden for mikroskop (LED) og datamaskinen (se Materialfortegnelse).
  2. Åpne programmet og åpne en ny fil. Under Fil øverst til venstre på skjermen klikker du Ny.
  3. Klikk på Collect, velg Eksperimenter, og velg deretter "iPSC + Calcium".
  4. Slå på klimakontrollenheten. Sett temperaturen til 37 °C og CO2 -nivået til 5 %.
  5. Bytt ut dyrkningsmediet hiPSC-CM med Tyrode-løsning (0,5 ml/brønn i en 24-brønnsplate). Sett på platelokket med klimakontrolllokket.
    MERK: Hvis kalsiumforbigående målinger må utføres, last cellene med Fura-2 AM, som beskrevet i avsnitt 4.
  6. Plasser platen inne i det optiske målesystemet når klimakontrollenheten viser at temperaturen er 37 °C.
    MERK: Sammentrekning måles ved hjelp av brightfield-forhold.
  7. Klikk på Åpne cellesøker under verktøylinjen og vent til en ny skjerm dukker opp. Øverst til høyre på skjermen velger du plateformat og brønn.
  8. Velg en brønn, velg et område i brønnen for å observere synkronisert sammentrekning og avslapning, Trykk på start, klikk på Legg til måling. Velg varigheten av målingene i innstillingene (10 s per område). Kast asynkroniserte sammentrekningsmålinger umiddelbart og velg et nytt område.
    MERK: Kontraktilitetstransientene i sanntid kan sees på skjermen. For synkroniserte sammentrekninger observeres en jevn kontinuerlig transient, mens for asynkroniserte sammentrekninger observeres små ekstra topper.
  9. Mål flere områder i brønnen avhengig av størrelsen på brønnen. For eksempel, for å følge denne studien, måle 10 områder per brønn i en 24-brønns plate. Hvis det bare er behov for basismålinger og det ikke foreligger noen plan om å teste noen forbindelser, fortsetter du fra trinn 3.13.
  10. Etter at områdene i en brønn er målt, trykk komplett og åpne det optikkbaserte måleinstrumentet for å legge til stressoren/forbindelsen til brønnen (f.eks. 500 nM ISO, oppløst i Tyrode).
  11. Velg inkubasjonstiden avhengig av forbindelsen av interesse (2 min med ISO i denne protokollen).
  12. Klikk på automatisk måling for å la det optikkbaserte måleinstrumentet utføre målinger i de samme områdene der referansemålingene ble utført, noe som resulterer i parvise målinger i brønnen.
  13. Trykk på fullført når alle målingene i brønnen er utført.
  14. Velg neste brønn øverst til høyre på skjermen.
  15. Fortsett målingene for alle nødvendige brønner.
  16. Klikk stopp når alle nødvendige brønner er målt og lagre filen.
    MERK: Klimakontrollen brukes til å opprettholde stabil CO2. Dette gjør det mulig å måle effekten av forbindelser/stressfaktorer på hiPSC-CM på en høyhastighets måte.

4. Kalsium forbigående målinger

  1. Tilbered 37 °C Tyrode oppløsning.
  2. Løs opp Fura-2 AM-alikotene i Tyrode-løsningen slik at en endelig konsentrasjon på 1 μM Fura-2 AM blir tilsatt cellene.
    MERK: Når du bruker Fura-2 AM, må du kontrollere at lysene i strømningshetten er slått av for å minimere lyseksponering.
  3. Aspirer mediet og erstatt det med Tyrode oppløsning inneholdende Fura-2 AM.
  4. Inkuber i 15 minutter ved 37 °C i en inkubator eller i det optikkbaserte målesystemet.
  5. Fjern Tyrode oppløsningen inneholdende Fura-2 AM, og vask deretter 2x med ny Tyrode oppløsning. Til slutt, inkuber cellene i Tyrode-oppløsningen i ytterligere 5 minutter ved 37 °C for å tillate de-forestring av Fura-2 AM.
  6. Plasser platen inne i det optiske målesystemet og start målingene, som beskrevet i avsnitt 3.
    MERK: I trinn 4.6. Ved å starte målingene samtidig med kontraksjonsmålingene, registreres en ratiometrisk kalsiumtransient: eksitasjon ved 340 nm og 385 nm i et 100 μm punkt; Utslipp samlet ved 510 ± 40 nm. I tillegg til kontraktilitetssporene vil sanntidsratiometriske kalsiumtransienter vises på skjermen.

5. Dataanalyse

  1. Hvis du vil analysere dataene, klikker du CytoSolver på skrivebordet.
  2. Klikk på importer og velg filen (e) som skal analyseres.
  3. Etter at programmet har utført analysen, observer de aksepterte (blå) og avviste (røde) transientene som vises på skjermen (figur 1A).
    MERK: Her ble følgende standard avvisningskriterier, definert ved signal/støy-forhold (SNR) og tilpasningsgodhet (R 2), brukt: R 2 > 0,9 og SNR > 4 for kontraksjonstransienter, og R2 > 0,5 og SNR > 3 for kalsiumtransienter. Disse avvisningskriteriene kan justeres av brukeren avhengig av kvaliteten på målingene, kvaliteten på cellene og det primære utfallet for forskeren. For eksempel, hvis forskerens interesse hovedsakelig er avslapningskinetikk, kan kriteriene senkes for tiden til toppvariabler. Hvis svært sterke kalsiumtransienter oppnås, kan det hende at SNR må økes for å utelukke data som er mer støyende.
  4. Klikk på eksport og merk av for gjennomsnittlige forbigående data. Inspiser de analyserte dataene som presenteres i et regneark.
  5. Slå av datamaskinen og alle de andre instrumentene.

Representative Results

Etter denne protokollen ble det utført målinger av kontraktilitet, Ca2+ -transienter og respons på en forbindelse i hiPSC-CM. Ved å bruke dette optikkbaserte målesystemet kunne hiPSC-CM enkelt repliseres på de nødvendige platene, og kontraktilitetsmålingene kunne utføres. Kontraktilitet måles i et interesseområde på 100 μm x 100 μm ved 250 bilder per sekund ved å beregne pikselkorrelasjonen i forhold til en referanseramme. Referanserammen registreres automatisk av systemet ved endediastolen. Samtidig med kontraksjonsmålingene registreres en ratiometrisk kalsiumforbigående.

I denne studien ble tre ulike runder med differensiering brukt som tre biologiske replikater. For hver batch differensiering ble tre brønner målt som tekniske replikater. Denne studien ble utført med 24-brønnsplater, og 10 områder i hver brønn ble målt. Etter målingene ble CytoSolver-programmet brukt til å analysere dataene umiddelbart. Følgende parametere ble rapportert: hvileslagfrekvensen, TP. Con, og TB. Con80 av kontrollen hiPSC-CMs (figur 2A-C). For å visualisere variasjonen i data for hver nevnte parameter, presenteres målingene innenfor hver brønn og gjennomsnittsverdiene for tre brønner for hver differensieringsrunde som superplott10. For bedre å evaluere variabiliteten av data for hver runde med differensiering og mellom de tre rundene, ble varianskoeffisienten (figur 2D) for hver parameter beregnet. Som vist i figur 2D, faller verdiene av tekniske replikater som svarer til en biologisk replikat innenfor et svært nært område til hverandre (dvs. lav varianskoeffisient), noe som illustrerer robustheten til denne metoden.

Denne applikasjonen er veldig godt egnet til å teste narkotikaeffekter. Her ble effekten av 500 nM ISO, en ikke-selektiv β-adrenerg reseptoragonist, på kontraktiliteten til kontrollhisc-CM testet. Denne forbindelsen er kjent for å øke hjertefrekvensen og utøve en positiv lusitrop effekt. Som vist i figur 3A, økte ISO signifikant slagfrekvensen i alle brønner. ISO økte også kinetikken, tydelig i en reduksjon i TP. Con og TB. Con80 (figur 3B,C). Samlet sett, ved inkubasjon med ISO, ble slagfrekvensen signifikant økt i alle brønner, sammen med en reduksjon i sammentreknings- og relaksasjonstiden, noe som indikerte at den forventede responsen på denne forbindelsen ble registrert av denne plattformen.

Parallelt med kontraktilitetsmålinger ble det også utført kalsiummålinger. På samme måte som kontraktilitetsdata (figur 2) er hiPSC-CMs kalsiummålingsdata vist i figur 4. TB.Ca80 er betydelig langsommere enn i isolerte kardiomyocytter fra rotter eller mus, noe som delvis forklares av arts- og hjertefrekvensforskjeller11, samt av umoden kalsiumhåndtering i hiPSC-CM på grunn av lavere kalsiumdynamikk i sarkoplasmatisk retikulum og lavere ekspresjon av kalsiumhåndteringsproteiner sammenlignet med primære celler12. I likhet med kontraktilitetsdata ble varianskoeffisienten for kalsiummålinger beregnet, og viser lav variabilitet innen de tekniske og biologiske replikatene (figur 4C).

Figure 1
Figur 1: Umiddelbar bruk av det forbigående analyseverktøyet CytoSolver etter eksperimentet for å analysere dataene. (A) Et eksempel på aksepterte transienter (alle i blått) av ett område målt i en brønn. Panel A1 viser de kontraktile transientene. Panel A2 representerer kalsiumtransientene. (B) Gjennomsnittlig kontraktilitetstransient oppnådd fra målinger i tre brønner i en differensieringsrunde. Fra hver enkelt eller gjennomsnittlig forbigående, data fra forskjellige tidspunkter til topp (TP. Samtidig) og tid til baseline (TB. Con) av kontraktilitetstransienten kunne ekstraheres. Siden den nøyaktige starten på sammentrekningen ikke alltid kan fastslås entydig, tas tid til topp 20% som utgangspunkt for målinger av tid til topp. På samme måte er det nøyaktige tidspunktet signalet returnerer til baseline vanskelig å vurdere. Derfor brukes tid til baseline 80% for å beskrive avslapningstiden. Her er TP. Con (tid til topp - tid til topp 20%) og TB. Con80 (tid til baseline 80% - tid til topp) brukes. (C) Gjennomsnittlige kalsiumforbigående data oppnådd fra målinger i tre brønner i en differensieringsrunde. Fra hver enkelt eller gjennomsnittlig kalsiumforbigående kunne data fra forskjellige tidspunkter til maksimum (TP.Ca) og tid til baseline (TB.Ca) kalsiumtransienter ekstraheres. For målinger fra tid til topp er startpunktet tid til maksimum 20 %, og for tid til grunnlinje er sluttpunktet tid til grunnlinje 80 %. I denne studien brukes TP.Ca(tid til topp - tid til topp 20 %) og TB.Ca 80 (tid til baseline 80 % - tid til topp). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Kontraktilitetsmålinger ved baseline utført på tre ulike runder med differensiering. Tre biologiske replikater og tre brønner for hver differensieringsrunde (dvs. tre tekniske replikater). Tre hovedsymboler for hver differensieringsrunde representerer gjennomsnittsverdien av de målte områdene (bakgrunnssymbolene i falmede farger) i hver brønn. Data er vist som gjennomsnitt ± SEM. Data om hvileslagfrekvens er representert i Hertz, og for TP. Con og TB. Con80, dataene er i sekunder. (A) Hvilende slagfrekvens. (B) Tid til topp (TP. Minus). (C) Tid til baseline 80 % (TB. Ulempe80). (D) For å evaluere variasjonen mellom dataene oppnådd i hver runde og mellom alle tre runder med differensiering, ble variansprosentkoeffisienten beregnet ved hjelp av gjennomsnittsverdiene for hver brønn. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Kontraktilitetsmålinger ved baseline (-) og etter inkubasjon med ISO (+) på tre brønner fra tre runder med differensiering. (A) Hvileslagfrekvensen (-) og slagfrekvensen etter inkubasjon med 500 nM ISO (+). (B) Tid til topp (TP. Con) målinger ved baseline og etter inkubasjon med ISO. (C) Tid til baseline 80 % (TB. Con80) målinger ved baseline og etter inkubasjon med ISO. For å evaluere effekten av ISO på kontraktilitetsparametrene ble det utført en toveis Anova med Bonferroni-korreksjon. Data er vist som gjennomsnitt ± SEM. Data om hvileslagfrekvens er representert i Hertz, og for TP. Con og TB. Con80, dataene er representert i sekunder. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Kalsiumtransientmålinger ved baseline utført på tre brønner fra tre runder med differensiering . (A) Tid til maksimum (TP.Ca) og (B) tid til baseline 80 % (TB.Ca80) kalsiumtransienter. Data vises som gjennomsnitt ± SEM. TP.Ca ogTB.Ca 80 data er representert i sekunder. (C) For å evaluere variasjonen mellom dataene oppnådd i hver runde og mellom alle tre runder med differensiering, ble variansprosentkoeffisienten beregnet ved hjelp av gjennomsnittsverdien for hver brønn. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Discussion

I denne studien beskrives en metode for å utføre kontraktilitets- og kalsiumtransientmålinger på hiPSC-CM og studere effekten av stressorer/medikamenter på disse cellene. Kontraktilitetsmålinger, ratiometriske kalsiummålinger og respons på ISO ble utført på tre forskjellige runder med differensiering som biologiske replikater. For hver biologisk replikat ble det utført målinger på tre brønner som de tekniske replikatene. Bakgrunnen for å utføre målingene på denne måten var å sikre at den biologiske variabiliteten og den tekniske variasjonen i prøven og plattformen kunne evalueres. Bortsett fra å vurdere riktig antall biologiske og tekniske replikater, kan hiPSC-CM-dyrkingstilstanden spille en viktig rolle for å oppnå konstante og robuste resultater. Det er viktig å være konsistent med kriterier, for eksempel alder av hiPSC-CMs, sammensetning av medium, replating forhold, og sammensatt inkubasjonstid under målinger. I denne studien tok det i gjennomsnitt 568 ± 24 s å måle 11 områder to ganger i 10 s i en brønn. Dette inkluderer en ISO-inkubasjonstid på 79 ± 11 s. Dette kommer ned til omtrent 10 min per brønn, noe som skal gjøre det mulig for forskere å måle en full 24-brønnsplate i ~ 4 timer. Klimakontrollen brukes til å opprettholde stabil CO2. Dette gjør det mulig å måle effekten av forbindelser/stressfaktorer på hiPSC-CM på en høyhastighets måte.

For å måle kontraktilfunksjonen til iPSC-CMs, er det flere eksisterende systemer som er avhengige av optogenetikk13 eller etikettfri videobasert mikroskopi 5,6. Optogenetikksystemer er ganske komplekse og krever spesielle teknikker for å oppnå enten elektrofysiske og / eller kontraktilitetsdata. Andre systemer er avhengige av post-hoc-analyse av videoer, noe som krever mye lagring og mangler direkte tilbakemelding under videooppkjøp. I tillegg er det vanskelig å oppnå tilstrekkelig tidsmessig og romlig oppløsning, noe som kan føre til undersampling. På samme måte kan CRISPR/CAS-9-redigerte hiPSC-CM med fluorescerende reportere7 introdusere uønskede effekter på kardiomyocyttatferd. Bruk av fluorescerende fargestoffer for sammentrekningsavslapningsmålinger er også en elegant tilnærming, men begrenser utførelsen av eksperimenter på samme prøve over en lengre periode14.

Denne optikkbaserte måleplattformen kan imidlertid brukes til å måle sammentrekningsavslapningstider uten å bruke fluorescerende fargestoff eller invasive metoder. Siden pikselkorrelasjon ikke gir romlig informasjon, kan denne metoden imidlertid ikke brukes til å måle styrken på sammentrekningen, men kan bare pålitelig oppdage endringer i hastigheten på sammentrekning og avslapning. Det introduserte målesystemet er temperaturkontrollert og kan samle kalsium- og kontraktilitetsdata i sanntid med en oppløsning på >200 bilder per sekund. I tillegg lagres plasseringen av hver måling, noe som muliggjør parvise målinger, og dermed øker kraften til eksperimentene. Videre gir denne plattformen forskere muligheten til å lagre data og analysere dem umiddelbart etter eksperimentet. Samlet sett viser dette optikkbaserte målesystemet seg å være en lovende metode for å studere cellulære patomekanismer, kan evaluere effekten av forbindelser på funksjonaliteten til hiPSC-CM, og kan være nyttig med den prekliniske prosessen i legemiddelscreening.

Disclosures

EM er ansatt i CytoCypher BV. MH er administrerende direktør i CytoCypher BV. De resterende forfatterne erklærer at forskningen ble utført i fravær av kommersielle eller økonomiske forhold som kan tolkes som en potensiell interessekonflikt.

Acknowledgments

Denne forskningen har delvis blitt finansiert av Eurostars-stipendet Estars2 113937 CARDIOMYO (EM &; DK) og NWO-VICI grant 91818602 (JV).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
µ-Plate 24 Well Black ID 14 mm ibidi 82421
B-27 Supplement (50x) Thermo Fisher 17504044
CytoSolver transient analysis tool CytoCypher A fast automatic data analysis tool
DMEM/F-12 Thermo Fisher 11320033
Fura-2, AM Thermo Fisher F1221
Isoprenaline hydrochloride Merck 15627
KnockOut™ Serum Replacement Thermo Fisher 10828010
Matrigel Merck CLS3542C Basement membrane
MultiCell CytoCypher with Nikon 20x Super Fluor objective and 730 nm LED light source and Ionwizard software CytoCypher Optics-based measurement system
ROCK inhibitor Y-27632 Tocris 1254
RPMI 1640 Thermo Fisher 11875119
Tyrode Self-made solution with final concentration of the following components: NaCl 134 mM, KCl 5 mM, Hepes 12 mM, MgSO4 1.2 mM, NaH2PO4 H2O 1.2 mM, Glucose 11 mM, Sodium Pyrovate 5 mM, 1 mM CaCl2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tsao, C. W., et al. Heart disease and stroke statistics-2022 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 145 (8), e153 (2022).
  2. Ghionzoli, N., et al. Current and emerging drug targets in heart failure treatment. Heart Failure Reviews. 27 (4), 1119-1136 (2022).
  3. Criscione, J., et al. Heart-on-a-chip platforms and biosensor integration for disease modeling and phenotypic drug screening. Biosensors and Bioelectronics. 220, 114840 (2023).
  4. vander Velden, J., et al. Animal models and animal-free innovations for cardiovascular research: current status and routes to be explored. Consensus document of the ESC Working Group on Myocardial Function and the ESC Working Group on Cellular Biology of the Heart. Cardiovascular Research. 118 (15), 3016-3051 (2022).
  5. Maddah, M., et al. A non-invasive platform for functional characterization of stem-cell-derived cardiomyocytes with applications in cardiotoxicity testing. Stem Cell Reports. 4 (4), 621-631 (2015).
  6. Sala, L., et al. MUSCLEMOTION: A versatile open software tool to quantify cardiomyocyte and cardiac muscle contraction in vitro and in vivo. Circulation Research. 122 (3), e5-e16 (2018).
  7. Sharma, A., et al. CRISPR/Cas9-mediated fluorescent tagging of endogenous proteins in human pluripotent stem cells. Current Protocols in Human Genetics. 96 (1), 1-20 (2018).
  8. Wang, L., et al. Hypertrophic cardiomyopathy-linked mutation in troponin T causes myofibrillar disarray and pro-arrhythmic action potential changes in human iPSC cardiomyocytes. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 114, 320-327 (2018).
  9. Luo, X., et al. IP3R-mediated compensatory mechanism for calcium handling in human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes with cardiac ryanodine receptor deficiency. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 772 (2020).
  10. Lord, S. J., Velle, K. B., Mullins, R. D., Fritz-Laylin, L. K. SuperPlots: communicating reproducibility and variability in cell biology. The Journal of Cellular Biology. 219 (6), e202001064 (2020).
  11. Milani-Nejad, N., Janssen, P. M. L. Small and large animal models in cardiac contraction research: advantages and disadvantages. Pharmacology and Therapeutics. 141 (3), 235-249 (2014).
  12. Karbassi, E., et al. Cardiomyocyte maturation: advances in knowledge and implications for regenerative medicine. Nature Reviews Cardiology. 17 (6), 341-359 (2020).
  13. Klimas, A., Ortiz, G., Boggess, S. C., Miller, E. W., Entcheva, E. Multimodal on-axis platform for all-optical electrophysiology with near-infrared probes in human stem-cell-derived cardiomyocytes. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 154, 62-70 (2020).
  14. van Meer, B. J., et al. Simultaneous measurement of excitation-contraction coupling parameters identifies mechanisms underlying contractile responses of hiPSC-derived cardiomyocytes. Nature Communications. 10 (1), 4325 (2019).

Tags

Biologi utgave 195

Erratum

Formal Correction: Erratum: Real-Time Measurements of Calcium and Contractility Parameters in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes
Posted by JoVE Editors on 12/13/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Real-Time Measurements of Calcium and Contractility Parameters in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. The Authors section was updated from:

Rafeeh Dinani1,2
Emmy Manders1,2,3
Michiel Helmes1,2,3
Lili Wang4
Bjorn Knollmann4
Diederik W. D. Kuster1,2
Jolanda van der Velden1,2
1Division of Physiology, Amsterdam UMC, Vrije University
2Heart Failure & Arrhythmias, Amsterdam Cardiovascular Sciences
3CytoCypher BV
4Division of Clinical Pharmacology, Vanderbilt School of Medicine

to:

Rafeeh Dinani1,2
Emmy Manders1,2,3
Michiel Helmes1,2,3
Lili Wang4
Bjorn C. Knollmann4
Diederik W. D. Kuster1,2
Jolanda van der Velden1,2
1Division of Physiology, Amsterdam UMC, Vrije University
2Heart Failure & Arrhythmias, Amsterdam Cardiovascular Sciences
3CytoCypher BV
4Division of Clinical Pharmacology, Vanderbilt School of Medicine

Sanntidsmålinger av kalsium- og kontraktilitetsparametere i humane induserte pluripotente stamcelleavledede kardiomyocytter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dinani, R., Manders, E., Helmes, M., … More

Dinani, R., Manders, E., Helmes, M., Wang, L., Knollmann, B. C., Kuster, D. W. D., van der Velden, J. Real-Time Measurements of Calcium and Contractility Parameters in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. J. Vis. Exp. (195), e65326, doi:10.3791/65326 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter